邹月丽|刘雅彤|王玉阳|张倩倩|李静怡|罗曦月|袁英凯|赵丽霞
中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学文理学院化学系，邮编150030
摘要
硫化氢（H₂S）作为一种有害物质，因导致生态污染而受到关注。然而，由于缺乏针对H₂S的特异性检测工具，慢性肝病病理进展过程中内源性硫化氢水平的变化尚未得到充分了解。本研究开发了一种新型的聚集诱导发射（AIE）荧光探针HBA，以实现对外源性和内源性H₂S的高选择性检测。HBA具有优异的水溶性、高选择性、低检测限（0.45 nM）、快速响应性、高荧光量子产率（18.51%）以及低细胞毒性，并能产生强烈的荧光。多项机制实验表明，该探针与H₂S发生环化反应，导致荧光淬灭后呈现亮黄色，随后变为无色。我们利用HBA的这一特性，检测了实际水样以及鱼、猪肉和虾等食物在变质过程中的H₂S含量。此外，还对HepG2细胞和斑马鱼胚胎进行了成像，并对构建的NAFLD小鼠模型进行了油红（Oil Red）和H&E染色。进一步的小鼠生物成像实验表明，HBA探针可能是临床诊断和环境检测中检测内源性H₂S的强大工具。
引言
众所周知，肝脏作为生物体内最大的实质器官和消化腺，具有分泌、排泄、合成、生物转化和免疫防御等重要功能[1]、[2]。非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是一种严重的公共卫生问题，其全球患病率预计将超过32.4%，成为未来肝脏移植的主要原因[3]、[4]、[5]、[6]。作为一种与代谢紊乱密切相关的慢性肝病，NAFLD的发病机制涉及遗传因素和环境因素的相互作用，如胰岛素抵抗、肠道微生物群失衡、脂质代谢和氧化应激[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。此外，不健康的生活方式（如缺乏运动和过量摄入热量）会显著增加NAFLD的风险，从而加速肝纤维化、脂肪性肝炎甚至肝癌等严重肝病的发生[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。因此，亟需建立一种快速、高灵敏度和准确的NAFLD诊断工具，并实施有效的预防和控制策略以降低该病的发病率[18]、[19]。
硫化氢（H₂S）作为一种内源性气体信号分子，来源于细胞内的硫储存，也可通过酶促或非酶促生化反应产生。它调节氧化应激和信号转导[20]、[21]、[22]、[23]。然而，环境中H₂S的异常升高会导致其在体内长期积累，引发健康问题[24]、[25]、[26]。最新研究表明，某些疾病（如肝硬化、阿尔茨海默病和糖尿病）可能与H₂S有关[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。此外，过量的H₂S会影响肝脏功能。因此，直接靶向H₂S或其下游酶是治疗肝病的有效策略[32]、[33]。先前研究发现，高脂饮食的小鼠肝脂肪变性风险增加，从而导致肝脏中H₂S的产生增多[34]、[35]。因此，建立一种安全有效的H₂S水平快速检测方法，有助于改善NAFLD的监测和治疗。
为了解决上述问题，荧光成像作为一种有效技术，被广泛用于细胞生物活性分子的动态监测[36]。特别是荧光探针检测技术在离子色谱、原子吸收光谱、电化学分析等多种传统检测技术中表现出色，因其高选择性、低检测限、快速响应、操作简便和低成本而广泛应用于体外和体内的H₂S检测[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]。近年来，H₂S探针的研究进展包括针对线粒体的传感器和用于监测肝脏相关损伤的双位点传感器[42]、[43]，但在NAFLD特异性应用方面仍存在选择性和生物相容性的不足。近年来，基于三苯胺的荧光团因结构简单、光学性能优异和合成成本低而受到广泛关注[44]、[45]、[46]。与传统的ACQ荧光材料相比，聚集诱导发射（AIE）荧光材料具有更高的荧光发射强度、更高的信噪比、聚集状态下的较大斯托克斯位移以及优异的光稳定性，这使其在生物成像中具有优势，并为AIE荧光材料在各种传感应用中提供了新的机会[47]、[48]、[49]、[50]。因此，它们克服了ACQ发射体在生理环境中的局限性[51]。因此，有必要开发一种以三苯胺为荧光基团的新型AIE荧光探针，以实现H₂S的特异性检测，从而改进NAFLD的诊断[52]。
在本研究中，我们设计了一种基于AIE的荧光探针HBA，用于选择性检测内源性H₂S。光谱实验表明，HBA具有高选择性、高灵敏度和极低的细胞毒性，以及强烈的荧光发射（Φ = 18.51%）。高分辨率质谱（HRMS）、红外滴定光谱（FT-IR）和核磁共振氢滴定（¹H NMR）的结果显示，H₂S与HBA探针发生环化反应，导致荧光淬灭并使颜色从亮黄色变为无色。这一现象被用于检测变质食品（鱼、猪肉、虾）中的H₂S含量。此外，HBA还适用于多种生物成像应用，包括HepG2细胞的可视化、斑马鱼胚胎的追踪，并可用于构建NAFLD小鼠模型。随后通过组织病理染色（油红O/H&E染色）和AST/ALT酶含量测量验证了模型的构建效果。最后，对小鼠进行了体内和内脏肝脏组织的分析，证实HBA能够有效分析内源性H₂S，从而诊断脂肪肝病。
试剂和仪器
三苯胺硼酸、5-溴呋喃-2-羧醛、超纯水、碳酸钾、四（三苯基膦）钯、四氢呋喃（THF）、蒸馏水、二氯甲烷（DCM）、饱和氯化钠、无水硫酸钠、3-氨基-4-羟基苯甲酸、无水乙醇；其他分析物包括：S²⁻、F⁻、Cl⁻、Br⁻、I⁻、SCN⁻、CH₃COO⁻、BF₄⁻、CO₃²⁻、HCO₃⁻、NO₃⁻、SO₃²⁻、HSO₃⁻、HPO₄²⁻、CN⁻、ClO⁻、S₂O₃²⁻、CrO₄²⁻、SO₄²⁻、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、丙氨酸
荧光探针HBA的光谱响应
最初，通过荧光光谱实验对合成的荧光探针HBA进行了表征，以验证其AIE特性[55]。其光谱性质分析（图1A&S6）显示，在纯水溶液中的荧光强度高于纯溶剂中的荧光强度。当DMSO/H₂O混合物中水的比例（fw）低于60%时，HBA的荧光强度减弱；当fw增加到70%时，HBA的荧光强度显著增强
实际水样中H₂S的检测
经过光谱分析和机制研究后，进一步使用HBA探针检测了来自不同环境（包括自来水、松花江水、土壤提取物、葡萄酒和乌龙茶）的实际样品中的H₂S含量。通过向水样中添加不同浓度的H₂S制备不同的水溶液，并通过荧光光谱的变化来监测H₂S含量。根据标准曲线（图S7b）计算得出的回收率如下
结论
本研究开发了一种基于聚集诱导发射（AIE）的荧光探针HBA，用于高选择性检测内源性H₂S。该探针在HEPES缓冲液中表现出优异的性能，具有优异的水溶性、高灵敏度（LOD = 0.45 nM）、快速响应性和强荧光发射（Φ = 18.51%）。通过HRMS、FTIR和¹H NMR光谱的机制研究揭示，H₂S的刺激会引发
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了黑龙江省省级高校“优秀青年教师基础研究支持计划”（YQJH2023204）和黑龙江省自然科学基金（ZL2024C009）的支持，以及东北农业大学本科生创新培训计划的资助。
