将血浆蛋白质组学与细胞因子谱相结合，可以识别儿童急性早期中性粒细胞减少症（ANE）的免疫病理生物标志物

本研究以发热惊厥为对照，通过血浆蛋白组学分析发现急性坏死性脑病患儿早期存在398个差异蛋白，涉及抗原呈递、免疫反应等通路，并筛选出8个关键蛋白作为生物标志物，经独立队列验证显示其诊断潜力。

范朝楠|宋志宏|李克春|李飞|赵光远|霍峰|何静|金丹群|霍玉峰|王怀丽|郑莉|王全|钱素云

首都医科大学附属北京儿童医院儿科重症监护室，国家儿童健康中心，北京100045

摘要

儿童急性坏死性脑病（ANE）是一种病情进展迅速、死亡率高的严重疾病，可能伴有细胞因子风暴。早期ANE缺乏独特的临床特征，其初始症状与热性惊厥（FS）相似，但结局不同。在本研究中，我们利用FS作为对照，通过血浆蛋白质组学分析来识别与ANE中的细胞因子风暴相关的血浆生物标志物。我们发现了398种在ANE患者中差异表达的蛋白质，其中345种上调，53种下调，这些蛋白质主要富集在抗原处理和呈递、细胞趋化性、免疫反应、代谢和细胞基质黏附等生物学途径中。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA），我们进一步确定了与细胞因子风暴相关的蛋白质模块和枢纽蛋白，并最终选出了8种关键蛋白质（APOE、GAPDH、TPI1、SPP1、ENO1、COL1A1、LUM和A2M）作为免疫病理生物标志物。这些发现通过靶向定量蛋白质组学在独立队列中得到了验证，ROC分析显示了它们的诊断潜力。本研究为ANE的早期诊断奠定了基础，并确定了有前景的治疗干预靶点。

引言

急性坏死性脑病（ANE）是一种罕见且进展迅速的危及生命的脑病，主要影响5岁以下的儿童。它通常发生在病毒感染之后，如甲型流感病毒、乙型流感病毒、COVID-19、人类疱疹病毒-6型和副流感病毒引起的感染。¹不幸的是，ANE已成为流感病毒或COVID-19感染后的主要死因。²ANE的死亡率超过30%，仅有约10%的患者能够完全康复。³

尽管有明确的感染触发因素，ANE的发病机制仍不清楚。尚未在死亡患者的脑脊液（CSF）或脑组织样本中检测到病原体的直接证据。⁴有假说认为，感染后异常的宿主免疫反应可能是ANE发作的主要驱动因素。^{5, 6}虽然在急性期IL-6和肿瘤坏死因子α（TNFα）等细胞因子的水平升高，但这些细胞因子的升高并不特异于ANE，也可见于其他类型的急性脑病。^{7, 8}

ANE早期急性阶段的具体表现尚缺乏。⁹初始症状通常包括高热或超高热，随后迅速出现惊厥、意识改变和昏迷。这些症状通常在发热后24至72小时内出现，在某些情况下甚至可能在24小时内出现。在严重的情况下，ANE可迅速导致颅内高压、脑疝，甚至脑功能衰竭或死亡。¹⁰双侧丘脑的对称性损伤是诊断ANE的特征性影像学表现。^{11, 12}然而，在一些患者的早期急性阶段，影像学改变可能并不明显。^{7, 13}

ANE的初始临床表现，包括高热和抽搐，与热性惊厥（FS）非常相似。¹⁴FS是6个月至5岁儿童中最常见的癫痫类型，通常由病毒感染引发¹⁵，也与IL-1、IL-6和TNF-α等炎症介质的释放有关。¹⁶然而，与ANE不同，FS是一种良性疾病，通常不会导致脑损伤。因此，在本研究中，我们以FS作为对照，旨在识别ANE早期急性阶段特定的血浆蛋白谱。通过结合蛋白质组学和临床特征（特别是细胞因子特征）的综合分析，我们确定了8种能够准确反映ANE血浆蛋白质组学特征的免疫病理生物标志物。这些生物标志物在独立队列中得到了验证，为了解ANE的免疫机制提供了新的见解，并为推进诊断和治疗策略奠定了基础。

患者招募和样本收集

我们从ANE患儿队列（队列1）中收集了血液样本，其中包括11名确诊的ANE患儿，以及9名作为对照的热性惊厥（FS）患儿（图1）。所有参与者均来自首都医科大学附属北京儿童医院，招募时间介于2018年12月至2020年6月之间。验证队列（队列2）包括来自三个儿童医疗中心的26名ANE患儿和12名FS患儿——其中部分患儿来自首都医科大学附属北京儿童医院

ANE患儿的血浆蛋白质组学特征分析

使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析了队列1的血浆蛋白质组学数据（图2A），共鉴定出2,473种蛋白质。其中1,706种蛋白质被定量（图S1A）。ANE患儿检测到的蛋白质数量多于对照组（图S1A），且两组之间的蛋白质水平差异明显（图S1B）。为了进一步研究ANE患儿与对照组之间的蛋白质表达差异

讨论

在我们的研究中，我们在急性期早期（发热后2天内及入院后24小时内）收集了ANE患儿的血液样本，与FS患儿相比发现了398种差异表达的蛋白质。其中345种蛋白质上调，主要参与抗原处理和呈递、免疫及代谢途径。此外，53种蛋白质下调，许多与细胞趋化性、细胞基质黏附和胶原蛋白有关

数据共享声明

本研究生成或分析的所有数据均包含在正文中和/或补充材料中。如需进一步数据，可向通讯作者提出合理请求。

编辑支持

作者感谢American Journal Experts在语言编辑方面提供的支持。

作者署名协议

所有作者均已审阅并同意期刊的作者署名标准。手稿的最终版本已由所有列出的作者阅读并批准。

作者贡献

钱素云：概念构思、方法学设计、项目监督。王全：项目监督、项目管理、写作及审稿编辑。范朝楠：写作-初稿撰写、概念构思、数据可视化。宋志宏：写作-初稿撰写、正式分析、数据可视化。李克春：研究工作、资源协调、数据管理。赵光远：研究工作、资源协调。霍峰：研究工作、资源协调。何静：研究工作、资源协调。霍玉峰：研究工作

资助

本研究得到了北京Nova计划（20240484656）和首都医科大学附属北京儿童医院健康改善与研究基金（编号2020-2-2094）的支持。

未引用的参考文献

²¹

CRediT作者贡献声明

范朝楠：写作-初稿撰写、资金争取、数据管理。宋志宏：软件开发、方法学设计。李克春：方法学设计、正式分析。李飞：正式分析、数据管理。赵光远：验证工作、资源协调。霍峰：资源协调、数据管理、概念构思。何静：数据可视化、验证工作、数据管理。金丹群：资源协调、正式分析、数据管理。霍玉峰：软件开发、正式分析、数据管理。王怀丽：正式分析、数据管理。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。所有作者均已阅读并遵守期刊关于潜在利益冲突披露的政策。

致谢

我们衷心感谢参与本研究的所有家庭和个人，同时非常感谢北京儿童医院PICU全体工作人员的奉献和努力。