综述：生成和调控细胞内过硫化物与多硫化物的酶：机制见解与抑制剂

本综述系统梳理了CBS、CSE、3MST、CARS、SQOR、ETHE1和TST等关键酶在活性硫物种（RSS）生成与代谢中的核心作用，聚焦其催化机制（如PLP依赖、FAD介导）及代表性抑制剂（如AOAA、PAG、I3MT-3、STI1）。文章强调选择性抑制剂对阐明RSS在氧化还原信号、代谢调控和线粒体功能中的生理病理意义至关重要，为相关疾病（如心血管病、癌症）的治疗策略提供了新视角。

引言

活性硫物种（RSS），包括过硫化物和多硫化物，是哺乳动物生理过程中的关键介质，参与氧化还原信号传导、代谢调控、自由基清除和抗炎反应等多种重要生物学过程。这些分子的独特化学性质决定了其多样化的功能。例如，氢过硫化物/氢多硫化物在生理pH下主要以去质子化的阴离子形式存在，使其比硫醇具有更强的亲核性；而烷基化的多硫化物则表现出亲电性，易于与各种亲核试剂反应。此外，蛋白质半胱氨酸的过硫磺化修饰可防止其不可逆的过度氧化，而过硫化物在清除自由基、抑制脂质过氧化方面也展现出显著作用。

RSS的产生主要依赖于多种硫代谢酶的催化反应。其中，胱硫醚β-合酶（CBS）、胱硫醚γ-裂解酶（CSE）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3MST）长期以来因其在硫化氢（H₂S）生物合成中的作用而被广泛研究。近期研究发现，它们同样具有产生过硫化物和多硫化物的潜力。此外，半胱氨酰-tRNA合成酶（CARS），特别是其线粒体亚型CARS2，被认为是细胞内半胱氨酸过硫化物（CysSSH）的主要来源。在线粒体中，参与硫化氢氧化途径的酶，包括硫化物:醌氧化还原酶（SQOR）、过硫化物双加氧酶（ETHE1）和硫代硫酸硫转移酶（TST），也对维持和调节细胞内过硫化物水平起着关键作用。

尽管对RSS生理功能的理解日益加深，但每种酶在特定生物学事件中的具体贡献仍不清楚。基因敲除或敲低等遗传学方法虽然强大，但常常会激活补偿性通路，使得难以确定每种酶的特异性作用。相比之下，针对每种酶的选择性抑制剂可以在特定时间点以剂量依赖的方式阻断其活性，从而实现更精细的实验控制。小分子抑制剂也可能具有治疗潜力。本综述旨在全面概述过硫化物和多硫化物生物合成与调控的酶促反应机制，并重点介绍关键抑制剂及其作用模式。

酶及其反应途径

过硫化物和多硫化物的生物合成和调控由几个关键酶协同完成。CBS和CSE都是磷酸吡哆醛（PLP）依赖性酶，在转硫途径中依次发挥作用，将同型半胱氨酸和丝氨酸转化为胱硫醚，进而产生半胱氨酸。除了这些经典反应，这两种酶也被提出可以利用替代底物（如胱氨酸和同型半胱氨酸用于CBS，半胱氨酸或同型半胱氨酸用于CSE）来产生H₂S。研究表明，CBS和CSE也能以胱氨酸为优先底物，在体外产生半胱氨酸过硫化物（CysSSH）。然而，后续研究提出了修正观点，认为CBS和CSE在体内的主要作用是通过转硫途径贡献于半胱氨酸的生成，而CARS（能够以半胱氨酸为底物产生CysSSH）是细胞内CysSSH生物合成更主要贡献者。支持这一观点的证据之一是细胞内胱氨酸浓度远低于CSE对胱氨酸的K_m值，使得在生理条件下从胱氨酸高效形成CysSSH的可能性较低。尽管如此，在细胞内胱氨酸浓度显著升高的病理生理条件下，CBS和CSE仍可能产生CysSSH。

3MST是另一个参与H₂S生物合成的酶，也被报道能产生过硫化物种。它主要定位于线粒体，作为一种硫转移酶，催化由半胱氨酸通过半胱氨酸氨基转移酶（CAT）产生的3-巯基丙酮酸转化为丙酮酸。3MST将3-巯基丙酮酸的硫转移到其活性位点半胱氨酸上，形成3MST结合的过硫化物中间体。该中间体随后将其硫转移给硫亲和性受体分子，如硫氧还蛋白（Trx）。研究表明，3MST在小脑细胞悬液中能产生多种RSS，包括H₂S₂、H₂S₃、CysSSH和谷胱甘肽过硫化物（GSSH）以及H₂S。因此，该酶可能有助于体内蛋白质过硫化物以及低分子量过硫化物/多硫化物的生成。

CARS的经典功能是催化半胱氨酸与其对应的转移RNA（tRNA）的连接。研究发现，CARS还能催化一种新颖的PLP依赖性反应，以两分子半胱氨酸为底物产生CysSSH。该酶还可能利用CysSSH作为氨酰化底物，从而使其在翻译过程中能够掺入新生多肽。基因敲除实验表明，CARS2是CysSSH产生的主要酶。对CBS/CSE/3MST三敲除小鼠的广泛硫代谢组学分析进一步支持了这一结论，显示三敲除小鼠的CysSSH水平与野生型相比无显著变化，而CARS2缺陷杂合子小鼠肝肺组织中的CysSHH水平则显著降低，凸显了CARS2在CysSSH生物合成中的主要作用。

在线粒体硫化氢氧化途径中，SQOR是一种黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖性酶，它起始H₂S的氧化，并与辅酶Q（CoQ）的还原相偶联。在催化过程中，FAD被还原为其二氢形式（FADH₂），随后还原CoQ。来自还原型CoQ的电子然后进入线粒体电子传递链复合体III。在SQOR催化的反应中，H₂S的硫在生理条件下被谷胱甘肽（GSH）接受生成GSSH。释放的GSSH随后被传递给下游酶ETHE1，该酶在其活性位点含有一个铁原子，催化GSSH转化为GSH和亚硫酸盐。随后，TST（与3MST同属硫转移酶家族）利用另一分子GSSH作为硫供体，将亚硫酸盐转化为硫代硫酸盐。或者，亚硫酸盐被亚硫酸盐氧化酶（SUOX）进一步氧化为硫酸盐。虽然H₂S是一种能结合细胞色素c氧化酶血红素并抑制线粒体呼吸的有毒气体，但它也作为线粒体电子传递链的电子供体。因此，SQOR及其下游酶通过调节H₂S和RSS（主要是GSSH）水平，在能量生成中扮演重要角色。

反应机制与抑制剂

CBS

CBS是转硫途径中一种PLP依赖性β-取代酶。它利用同型半胱氨酸和丝氨酸生成胱硫醚。在经典CBS催化反应中，丝氨酸首先与PLP形成外部醛亚胺。随后发生β-消除反应，释放一分子水，产生氨基丙烯酸中间体。该中间体是CBS反应的关键中间体，已通过时间分辨光谱直接观察到。接着，同型半胱氨酸的硫醇盐亲核攻击该氨基丙烯酸，导致胱硫醚形成。

哺乳动物CBS是一种特殊的PLP酶，含有血红素辅因子和S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）。虽然C端SAM结合位点远离催化中心，但研究发现SAM结合诱导催化核心的结构重排，从而解除自抑制并稳定激活构象。因此，SAM以变构方式增强酶活性。近期利用冷冻电镜（cryo-EM）可视化全长人CBS结构发现，全长酶组装成形成螺旋丝状结构的高阶寡聚体。SAM结合后，这些丝状结构的构象发生变化，从每圈三个CBS二聚体变为两个。这种构象变化导致调节结构域对催化核心活性位点的空间阻碍被移除。

氨基氧乙酸（AOAA）是历史上最常用的CBS抑制剂。虽然AOAA被认为是一种与PLP形成致死性肟复合物的不可逆抑制剂，但近期研究表明，在高浓度丝氨酸存在下，AOAA修饰的CBS催化活性可以被挽救。AOAA与人CBS复合物的晶体结构显示，肟中间体通过涉及Thr146、Thr150和Gln222新形成的氢键网络得以稳定。然而，需要注意的是，AOAA是一种广谱的PLP依赖性酶抑制剂，其对CSE和CBS的抑制活性相似，半抑制浓度（IC₅₀）值分别为1.1 µM和8.5 µM。因此，在解释细胞或体内实验时，必须考虑其有限的选择性。

为克服此局限性，已进行了大量高通量筛选以识别CBS抑制剂，但真正的CBS选择性化合物尚未发现。其中一种抑制剂CH004对CBS的IC₅₀值为1 μM，对CBS的抑制活性约为对CSE的30倍。研究表明CH004可逆地结合CBS，其解离常数（K_d）为0.6 μM。虽然CBS-CH004复合物的结构尚未报道，但Q222A突变在很大程度上消除了CH004的抑制活性，提示Gln222是其结合的关键残基。CH004的一个潜在问题是其也具有直接的H₂S清除活性，且后续研究提示其可能存在多个与CBS无关的靶点。

CSE

CSE是转硫途径中另一个PLP依赖性酶。它催化胱硫醚分解为半胱氨酸、α-酮丁酸和氨。在静息状态，PLP与活性位点赖氨酸残基（Lys212）以内部醛亚胺形式共价结合。胱硫醚首先进入活性位点与PLP形成外部醛亚胺，然后互变异构为酮亚胺，随后发生Cγ-S键断裂释放半胱氨酸。剩余的乙烯基甘氨酸酮亚胺中间体互变异构为PLP结合的氨基巴豆酸酯，随后水解释放α-酮丁酸和氨。最后，Lys212与PLP形成希夫碱，恢复静息状态。

除了经典的γ-裂解酶反应，CSE还能催化各种底物（包括半胱氨酸和胱氨酸）的β-消除反应。即，它具有从半胱氨酸和胱氨酸分别产生H₂S和CysSSH的体内潜力。前者反应据报道在心血管系统中尤为重要。后一反应已使用大鼠肝CSE进行详细分析，研究表明人CSE至少在体外也能催化此反应。相比之下，近期使用CBS/CSE/3MST三敲除小鼠的研究提示，线粒体CARS2是体内H₂S和CysSSH产生的主要贡献者。有研究发现，大鼠CSE中Cys136的过硫磺化抑制了其从胱氨酸生成CysSSH的β-裂解酶活性。类似地，人CSE中Cys137（相当于大鼠CSE的Cys136）的过硫磺化降低了其从半胱氨酸生成H₂S的β-裂解酶活性。这两项研究均提示该氧化还原敏感性半胱氨酸残基的过硫磺化作为一种负反馈机制，调节H₂S或CysSSH的产生。CSE和CARS在体内H₂S和CysSSH生物合成中的相对贡献仍有待完全阐明。

炔丙基甘氨酸（PAG）是CSE的不可逆抑制剂。它首先像其他CSE底物一样与PLP形成外部醛亚胺。据提出Lys212使PAG的β-位去质子化，产生反应性丙二烯中间体。该中间体被活性位点酪氨酸残基（Tyr114）亲核攻击，形成共价乙烯基醚加合物，导致酶抑制。CSE与PAG复合物的晶体结构证实了Tyr114与PAG的Cγ之间存在共价键。尽管据报道PAG对CSE的选择性高于CBS（以1 mM半胱氨酸为底物时，CSE催化反应的IC₅₀为40 μM，而即使在10 mM PAG下也未检测到对CBS的抑制），但它也抑制其他几种PLP酶，如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和甲硫氨酸γ-裂解酶。研究表明，PAG对CSE（以半胱氨酸为底物）的抑制程度取决于抑制剂与酶的预孵育时间以及半胱氨酸的浓度。他们提出半胱氨酸竞争性干扰PAG与酶的结合，从而阻止PAG完成与Tyr114形成致死性复合物。因此，在不同细胞内半胱氨酸水平的组织中，有效抑制CSE所需的PAG浓度可能差异很大。

作为替代的CSE抑制剂，研究识别了一种胱硫醚类似物S-3-羧丙基-L-半胱氨酸（CPC），具有可逆抑制机制。它通过抑制常数（K_i）值分别为50 µM和180 μM，抑制人CSE的胱硫醚裂解和H₂S产生。研究还证明其在浓度高达5-10 mM时，对其他PLP依赖性酶CBS和CAT或H₂S产生酶3MST不显示抑制活性。人CSE与CPC复合物的晶体结构也已报道，证实了PLP结合的氨基丙烯酸中间体的存在。

近期通过筛选包含161,600个化合物的大型化学库，识别出草酰肼作为一种有效的CSE抑制剂。它与CSE活性位点的PLP形成希夫碱，IC₅₀值为13 µM，并对其他PLP依赖性酶（包括CBS、丙氨酸氨基转移酶和甲硫氨酸γ-裂解酶）具有高选择性。基于大鼠CSE与该抑制剂复合物的晶体结构，解释了草酰肼对CSE的高选择性。在该结构中，PLP结合的草酰肼通过与其活性位点残基Glu339、Ser340、Arg375和Asn161形成的氢键得以稳定。重要的是，这些氨基酸在人CSE中是保守的，并且通过使用过表达该酶的HEK293细胞进行的细胞实验已证实草酰肼对人CSE的抑制活性。

3MST

3MST的催化涉及双底物乒乓机制。活性位点半胱氨酸首先攻击3-巯基丙酮酸，形成酶结合的半胱氨酸过硫化物中间体，同时释放丙酮酸。随后，该过硫化物的末端硫原子被转移给硫亲和性受体。人3MST的晶体结构显示，3-巯基丙酮酸定位于Arg188和Arg197附近，并通过氢键与之连接。提出Ser-His-Asp三联体有助于Cys248处硫醇盐的形成，使其能够亲核攻击3-巯基丙酮酸的硫原子。

迄今为止，已提出并研究了各种含硫醇生物分子作为硫受体，如Trx、二氢硫辛酸、半胱氨酸和钼辅因子合成蛋白3（MOCS3）。详细动力学分析表明，Trx是生理上首选的硫受体。Trx的米氏常数（K_m，2.5 μM）相对于生理Trx浓度（1–20 μM）合理较低。此外，人3MST对Trx的催化效率（k_cat/K_m）至少比对二氢硫辛酸或半胱氨酸高1000倍。从3MST接受硫后，Trx发生其邻近硫醇的分子内攻击，形成内部二硫键，从而产生氧化型Trx并释放H₂S。相比之下，还原型Trx与3MST相互作用并引起底物抑制，导致对3-巯基丙酮酸的K_m增加。因此，在氧化条件下，还原型Trx水平较低时，3MST的硫转移活性可能增强，导致低分子量RSS（如CysSSH）的产生增加。

研究识别出一种有效且选择性的3MST抑制剂，后称为I3MT-3或HMPSNE。该化合物对小鼠3MST的IC₅₀值为2.7 μM，并对大鼠CBS、大鼠CSE和牛硫氰酸酶显示出高选择性。测定I3MT-3对人3MST的IC₅₀值为13.6 μM。大鼠3MST与I3MT-3复合物的晶体结构揭示了一种独特的结合模式，其中活性位点半胱氨酸（Cys248）处的过硫磺化阴离子与嘧啶酮环带正电的羰基碳存在长距离静电相互作用（>3.45 Å）。还观察到与Arg188和Ser250的直接氢键，以及与Tyr108、Glu195、Arg197和Thr253的水介导氢键。此外，等温滴定量热法证明I3MT-3紧密且选择性地结合3MST的过硫磺化形式，K_d值为0.5 μM，而未检测到与还原型的结合。I3MT-3已成为抑制3MST依赖性生物能量学和肿瘤细胞增殖的标准药理学探针。

CARS

CARS催化通过ATP依赖性激活L-半胱氨酸形成半胱氨酰氨基酰-tRNA^Cys（Cys-tRNA^Cys），产生半胱氨酰腺苷酸（Cys-AMP），随后将半胱氨酸转移至tRNA^Cys的3′末端。除了这一经典作用，研究报道CARS还具有半胱氨酸过硫化物合酶（CPERS）活性，以PLP依赖性方式产生CysSSH。测定大肠杆菌CARS该反应的K_m为7.4 μM，相对于细胞内半胱氨酸浓度（100–1000 μM）足够低。使用稳定同位素标记半胱氨酸对CARS催化的CysSSH形成进行的LC-MS/MS分析进一步表明，硫从一个半胱氨酸分子转移至另一个。此外，使用大肠杆菌CARS进行的广泛突变分析显示，⁷³KIIK⁷⁶和²⁶⁶KMSK²⁶⁹基序内的赖氨酸残基对CPERS活性（而非氨酰化活性）重要，并可能作为PLP结合位点。有趣的是，这些KIIK和KMSK基序在包括哺乳动物在内的多种物种中高度保守，支持了它们在CPERS活性中的功能相关性。

在哺乳动物中，CARS有两种亚型：定位于胞质的CARS1和定位于线粒体的CARS2。两种亚型均具有CPERS活性。该研究以及后续的体内和代谢组学分析强化了CARS2是细胞内过硫化物主要来源的观点。还提出CARS2衍生的CysSSH从线粒体电子传递链组分接收电子，从而产生H₂S。该模型暗示CARS2不仅贡献于过硫化物生物合成，也可能通过作为涉及SQOR、ETHE1和TST的硫化氢氧化途径的上游而贡献于线粒体呼吸。然而，CARS介导的过硫化物形成的精确催化机制仍未解决。迄今为止，尚未报道特异性靶向CARS的CPERS活性的抑制剂。

SQOR

SQOR是一种与线粒体内膜相关的黄素蛋白，它利用CoQ作为电子受体和低分子量硫受体（最可能是GSH）催化H₂S的双电子氧化。人SQOR的第一个晶体结构于2019年报道，发现两个氧化还原活性半胱氨酸残基（Cys201和Cys379）被一个硫烷硫桥连，形成内部半胱氨酸三硫化物物种。该中间体先前被提出代表酶的失活形式，可能在缺乏外部硫受体时缓慢形成。相比之下，同年基于详细的结构和动力学实验，提出三硫化物物种是催化活性形式并代表酶的静息状态。与这一提议一致，通过氰化物处理破坏三硫桥导致酶的不稳定和失活。还基于计算建模和分子动力学模拟预测