N(3)-取代的噻吩-2-羧醛硫代半卡巴唑化合物及其铜(II)配合物：合成、表征、计算机模拟研究及抗癌活性

噻吩-2-羰基N(3)取代噻嗪酮及其Cu(II)配合物合成表征与抗癌活性研究。通过元素分析、FT-IR、UV-Vis、NMR、ESR及单晶X射线分析证实配合物为平面四方形结构，中心铜离子与配体形成Covalent键。体外实验显示HL1对MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞抑制率最高（0.75±0.27），且对正常PNT2细胞毒性低（0.97±0.10）。DFT计算验证结构稳定性，证明化合物符合药效团要求且符合Lipinski规则。

帕拉斯·纳特·亚达夫（Paras Nath Yadav）| 库尔迪普·马希亚（Kuldeep Mahiya）| 克里希纳·巴哈杜尔·塔鲁（Krishna Bahadur Tharu）| 西拉尼·普尼亚莫蒂（Shirani Punniyamoorthy）| 阿斯米塔·什雷斯塔（Asmita Shrestha）| 努坦·普拉萨德·巴塔拉伊（Nootan Prasad Bhattarai）| 尤巴·拉杰·波卡雷尔（Yuba Raj Pokharel）

尼泊尔加德满都特里布万大学（Tribhuvan University）化学系

摘要

本文合成了含有N(3)烷基取代基的噻吩-2-羧醛噻吩半卡巴唑化合物，包括N,N-二甲基-2-(噻吩-2-基亚甲基)肼-1-碳硫酰胺（HL¹）、N'-(噻吩-2-基亚甲基)噻吩morpholine-4-碳硫肼（HL²）、N'-(噻吩-2-基亚甲基)吡咯烷-1-碳硫肼（HL³）和N'-(噻吩-2-基亚甲基)氮杂环庚烷-1-碳硫肼（HL⁴），并通过元素分析、FT-IR、UV–Vis、¹H NMR、¹³C NMR、ESR、质谱以及单晶X射线分析对其进行了表征（Cu(II)复合物的研究参考：CuL(Bharti et al., 2003a⁴⁾

₂）。这些配体通过硫醇阴离子和氮杂甲基氮以双齿配位方式与Cu(II)离子结合，形成正方形平面结构。该化合物属于P₂₁/c空间群，属于单斜晶系，Cu-C键长分别为2.003 Å和2.2412–2.2477 Å。配体与Cu离子之间的键具有较高的共价性质（g值在2.046–2.075之间，高于电子亲和能g_e）。通过晶体紫实验检测了这些化合物对MDA-MB-231（乳腺癌）、MCF-7（乳腺癌）、A431（表皮样癌）和PNT2（正常前列腺上皮）细胞系的体外抗癌活性。在3 μM浓度下，HL¹对MDA-MB-231和MCF-7的抑制效果最显著（抑制率分别为0.75 ± 0.27和0.75 ± 0.15），而对PNT2的毒性较低（抑制率为0.97 ± 0.10，以未处理对照组为基准）。Cu(II)复合物处理后的正常细胞（PNT2）存活率较高，表明这些铜复合物对正常细胞无毒。此外，这些配体符合Lipinski五规则，显示出良好的药物特性。

引言

癌症是仅次于心血管疾病的第二大死亡原因，其治疗是全球关注的焦点。全球最常见的癌症类型包括肺癌、乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌。亟需具有广谱高效且低毒性的新型抗癌药物，因为现有化疗药物存在选择性差、耐药性和严重副作用等问题[1]。噻吩半卡巴唑类化合物具有多种生物活性，如抗菌、抗真菌、抗糖尿病、抗肿瘤、抗增殖、抗癌、除草和抗炎作用[2]。COTI-2用于妇科及其他实体瘤的治疗，3-AP用于宫颈癌或阴道癌的临床试验（图1）[3]。在大多数复合物中，噻吩半卡巴唑作为双齿配体，通过硫酰基和肼氮原子与金属结合；但在少数情况下，它们作为单齿配体仅通过硫原子结合[4]。噻吩半卡巴唑及其金属复合物的生物活性取决于母体醛和酮的结构以及所配位的金属离子。金属离子的存在显著增强了复合物的整体活性，有助于克服有机母体的副作用[5]。噻吩半卡巴唑配体的极性及其与带电金属离子的相互作用使得分子的疏水部分暴露在外，从而使其能够穿透细胞膜[6]。Tweedy的螯合理论也预测了这种行为，有助于金属复合物穿过细菌细胞的半透膜[7]。由于噻吩半卡巴唑对核糖核苷酸二磷酸还原酶的抑制作用及其对激素响应性癌症的选择性，这类化合物受到了广泛研究[8]。多年来，人们发现许多铜复合物具有显著的抗肿瘤活性[9]。近年来，人们通过修改噻吩半卡巴唑结构来提高其亲水性和降低毒性[10]。配体与金属的配位赋予复合物三维方向性，从而提高分子识别能力和生物活性[11]。在开发抗癌药物的持续努力中，我们最近发表了多种新化合物。5-甲氧基异丁啶N(4)吡咯烷基噻吩半卡巴唑能有效抑制细胞增殖、迁移和球形细胞形成，并通过激活线粒体内在凋亡途径发挥作用。该化合物在A431细胞系中恢复了突变的p53蛋白，为癌症治疗提供了新策略[12]。一系列5-甲氧基异丁啶噻吩半卡巴唑化合物在MCF-7、A431和A549细胞系中表现出抗癌活性，IC₅₀值在2.52–7.41 μM之间[13]。对5-羟基异丁啶噻吩半卡巴唑N(4)位点进行改良后，部分化合物对MD-AMD-231、MCF-7、A549、NCI-H460和A431细胞系的抗癌活性增强，IC50值在0.19–2.19 μM范围内[14]。机制研究表明，这些化合物通过抑制Ras/MAPK通路、诱导DNA损伤和DNA修复机制障碍以及降低ERK1/2表达来抑制癌细胞增殖[14]。铜结合的异丁啶噻吩半卡巴唑对A431和A549细胞系表现出显著的抗增殖活性。该化合物还通过克隆形成实验抑制了A431细胞的增殖，并减缓了细胞的迁移和伤口愈合能力[15]。RT-PCR和Western blot分析显示其诱导了Bax的表达，抑制了Bcl-2和Bcl-xl的活性。此外，该化合物通过激活JNK信号通路和抑制PI3K/AKT通路诱导了A431细胞的内源性凋亡[15]。一系列N(4)二甲基异丁啶噻吩半卡巴唑及其铜(II)复合物在体外对MCF-7、A431和PNT2细胞表现出显著的细胞生长抑制作用[16]。壳聚糖功能化的异丁啶和吡啶噻吩半卡巴唑及其铜(II)复合物也对MDCK和MCF-7癌细胞系具有抗增殖活性[17][18]。

我们报道了含有N(3)烷基和环取代基的噻吩-2-羧醛噻吩半卡巴唑化合物及其铜(II)复合物的合成方法。这些化合物通过多种光谱技术进行了表征，其中Cu(II)复合物CuL⁴₂的单晶结构也得到了解析。此外，还报告了这些化合物对PNT2、A431、MDA-MB-231和MCF-7细胞系的体外抗癌活性以及计算机模拟研究结果。

材料

使用的试剂为噻吩-2-羧醛（SRL）、噻吩morpholine（Sigma Aldrich）、肼（Fischer Scientific）、氯乙酸钠和N-甲基苯胺（Alfa Aesar）、二硫化碳（Qualigens Fine Chemicals）、六亚甲基胺、二甲胺和吡咯烷（SDFCL），均为试剂级，无需进一步纯化。PNT2、A431、MDA-MB-231和MCF-7细胞系购自印度浦那的国家细胞科学中心（National Center for Cell Science）。细胞培养使用Invitrogen公司的DMEM培养基。

红外光谱

由于噻吩半卡巴唑含有硫醇基（C=S）和相邻的质子，因此可能存在硫醇-硫醇互变异构。硫醇基通常不稳定，容易通过分子内质子转移转化为稳定的C-S单键[24][26]。然而，噻吩-2-羧醛N³噻吩半卡巴唑化合物在1227–1265 cm⁻¹处显示出强烈的吸收峰，这是由于C-S双键的振动[25]。在2500–2600 cm⁻¹范围内未观察到S-H键的吸收峰。

晶体结构描述

CuL⁴₂铜(II)复合物的结构及原子标记方案如图3所示。该化合物属于单斜晶系P₂₁/c，每个不对称单元包含两个化学上等效但晶体学上独立的分子，铜离子位于晶体学倒易中心，因此不对称单元仅包含化合物的一半。

图4展示了两个化学上等效分子的透视图。

讨论

噻吩半卡巴唑及其衍生物具有抑制核糖核苷酸还原酶、活性氧（ROS）生成、破坏线粒体的能力，最近还发现其能抑制多药耐药蛋白（MDR1）。我们研究了N(3)取代基噻吩半卡巴唑化合物及其铜(II)复合物对MDA-MB-231（乳腺癌）、MCF-7（乳腺癌）、A431（表皮样癌）和PNT2（正常前列腺）细胞的抗增殖活性。

密度泛函理论计算

使用GaussView 6.0程序设计了合成配体及CuL⁴₂的三维几何结构。气相优化和频率计算采用了3参数Becke、Lee-Yang-Parr（B3LYP）方法，Cu原子使用LANL2DZ基组，N、C、O和H原子使用6-311G’基组。B3LYP方法结合了计算效率和准确性。

结论

本研究证明了N(3)取代基噻吩-2-羧醛噻吩半卡巴唑化合物及其铜(II)复合物对乳腺癌细胞系（MDA-MB-231和MCF-7）具有显著的抗增殖活性。在测试的化合物中，HL¹在两种乳腺癌细胞系中表现出最高的抗癌活性，同时对PNT2细胞的毒性较低，表明其具有作为选择性抗癌剂的潜力。此外，CuL¹₂也表现出良好的效果。

作者贡献声明

帕拉斯·纳特·亚达夫（Paras Nath Yadav）：负责撰写初稿、监督和概念设计。库尔迪普·马希亚（Kuldeep Mahiya）：负责形式分析。克里希纳·巴哈杜尔·塔鲁（Krishna Bahadur Tharu）：负责方法学研究。西拉尼·普尼亚莫蒂（Shirani Punniyamoorthy）：负责数据整理。阿斯米塔·什雷斯塔（Asmita Shrestha）：负责软件操作。努坦·普拉萨德·巴塔拉伊（Nootan Prasad Bhattarai）：负责形式分析。尤巴·拉杰·波卡雷尔（Yuba Raj Pokharel）：负责撰写、审稿、编辑和实验监督。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢尼泊尔大学研究委员会提供的资助（FRG-73/74-S&T-05, 2018）。感谢南亚大学对化合物的生物筛选工作。同时感谢印度金奈的IIT Madras提供元素分析数据，以及新德里的贾瓦哈拉尔·拉尔·尼赫鲁大学（JNU）提供的¹H NMR、¹³C NMR和质谱数据。此外，还感谢尼泊尔科学技术学院提供的COSY和HSQC光谱数据。感谢Agni博士的支持。