ABSTRACT
蜡样芽孢杆菌群可引起严重的医院感染。该菌群携带染色体编码的β-内酰胺酶（包括bla1和BcII），这些酶参与β-内酰胺耐药，但其耐药机制尚不完全清楚。研究对48株血培养临床分离株及参考菌株ATCC14579进行基因组和表型分析，旨在阐明这些机制。基因组分析包括物种鉴定、多位点序列分型（MLST）和基于全基因组测序的β-内酰胺酶基因检测。同时进行β-内酰胺药敏试验、酶活性测定和β-内酰胺酶RT-qPCR分析。为此，研究开发了一种测量蜡样芽孢杆菌群酶活性的方法。48株分离株涵盖三个物种（30株Bacillus mosaicus、9株Bacillus cereus sensu stricto和9株Bacillus luti）和28个序列型。尽管所有B. luti分离株缺乏碳青霉烯酶基因，但它们对氨苄青霉素和美罗培南表现出较高的最小抑菌浓度范围。酶活性模式可分为组成型、诱导型或沉默型。所有B. luti分离株及部分B. mosaicus和B. cereus s.s.分离株对青霉素G表现出组成型酶活性，而大多数B. mosaicus和B. cereus s.s.分离株表现为诱导型活性，另有五株为沉默型活性。在诱导型组中，诱导活性似乎伴随着青霉素酶和碳青霉烯酶表达的升高。这是首个证明蜡样芽孢杆菌群内不同物种在碳青霉烯酶基因存在和β-内酰胺耐药谱方面存在差异的研究，为该菌群的β-内酰胺耐药机制提供了关键见解，并为进一步研究奠定了基础。
INTRODUCTION
蜡样芽孢杆菌群由革兰阳性、产芽孢的杆状细菌组成，在自然环境中广泛分布。该群包括遗传相似性高的密切相关物种，如炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。携带毒力质粒pXO1和/或pXO2的炭疽芽孢杆菌可引起可能致命的炭疽病。蜡样芽孢杆菌主要引起人类胃肠道感染，如食物中毒，但也可在免疫功能低下个体和新生儿中引起严重的侵袭性感染。苏云金芽孢杆菌对昆虫有致死性，被广泛用作生物杀虫剂。迄今为止，已有约20个物种被提议纳入蜡样芽孢杆菌群。使用表型鉴定方法或商业数据库的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱无法可靠区分蜡样芽孢杆菌群内的特定物种。全基因组测序是该菌群物种准确鉴定所必需的。由于鉴定困难，常规临床实验室实践中无法进行详细的物种分类。
除炭疽芽孢杆菌外，蜡样芽孢杆菌群中的大多数物种对青霉素和头孢菌素耐药。青霉素敏感性常被用来区分炭疽芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌群的其他物种，但炭疽芽孢杆菌的散在青霉素耐药性已有报道。在蜡样芽孢杆菌群中，包括炭疽芽孢杆菌，染色体β-内酰胺酶基因的表达被认为是导致β-内酰胺耐药的部分原因。染色体编码的β-内酰胺酶包括丝氨酸β-内酰胺酶bla1和金属β-内酰胺酶bla2。在青霉素敏感的炭疽芽孢杆菌菌株中，bla1和bla2几乎不转录，而半定量RT-PCR分析显示这些基因在耐药菌株中表达。
先前研究已证实bla1导致青霉素耐药。在青霉素耐药的炭疽芽孢杆菌菌株中删除bla1基因会导致氨苄青霉素最小抑菌浓度显著降低，而与炭疽芽孢杆菌遗传相似的苏云金芽孢杆菌在消除bla1后也表现出氨苄青霉素最小抑菌浓度降低。然而，bla2对碳青霉烯敏感性的影响尚不清楚。bla2于1966年被发现，是首个被发现的胞外金属β-内酰胺酶。尽管存在染色体碳青霉烯酶，蜡样芽孢杆菌群成员通常对碳青霉烯类抗生素敏感，且bla2的产生不足以赋予碳青霉烯耐药性。
蜡样芽孢杆菌群中β-内酰胺酶表达的调控机制已逐渐被阐明，近期研究表明胞外功能sigma因子在此过程中起关键作用。然而，详细的调控机制，特别是碳青霉烯酶表达的调控机制，仍然知之甚少。
在细菌中，核心RNA聚合酶与sigma因子结合形成全酶，从而启动转录。sigma因子决定启动子特异性，从而指导RNA聚合酶转录不同的基因集。ECF sigma因子是σ70sigma因子的一个亚家族。它们通常调控与细胞包膜相关的细胞过程，因此被称为“胞外功能”sigma因子。ECF sigma因子的一般调控途径涉及一种膜结合的抗sigma因子，该因子将sigma因子隔离在膜上，从而抑制其活性。当检测到胞外信号时，抗sigma因子被蛋白水解降解，释放sigma因子以激活靶基因的转录。
在蜡样芽孢杆菌群中，SigP作为ECF sigma因子发挥作用，其活性受其同源抗sigma因子RsiP抑制。这些组分被认为参与β-内酰胺酶表达的调控。青霉素耐药的炭疽芽孢杆菌菌株组成型表达β-内酰胺酶活性，而删除sigP–rsiP基因座则完全消除了该活性。在苏云金芽孢杆菌中，SigP调控多种β-内酰胺酶和青霉素结合蛋白，可能有助于β-内酰胺耐药。此外，ECF sigma因子在β-内酰胺抗生素暴露下上调β-内酰胺酶活性。然而，很少有研究调查金属β-内酰胺酶的表达水平或碳青霉烯耐药机制，金属β-内酰胺酶的作用及其对碳青霉烯耐药的贡献尚不清楚。碳青霉烯是治疗蜡样芽孢杆菌群引起感染的重要治疗选择；因此，了解碳青霉烯耐药机制对治疗临床感染性疾病具有重要意义。
测量酶活性对于阐明β-内酰胺抗生素的耐药机制至关重要。然而，在芽孢杆菌属中，β-内酰胺酶活性尚未被准确定量。革兰阳性菌将其产生的β-内酰胺酶分泌到胞外环境中。尽管先前研究测量了液体培养上清液中的酶活性，但这些测量未进行蛋白质含量标准化，因此酶活性测定尚未标准化。
本研究使用来自患者血培养的48株蜡样芽孢杆菌群临床分离株，并基于全基因组测序分析进行了详细的物种鉴定。研究开发了一种定量β-内酰胺抗生素酶活性的新方法，并对部分分离株进行了定量逆转录聚合酶链反应，以测量青霉素酶和金属β-内酰胺酶的表达水平。这揭示了β-内酰胺酶活性表现为三种不同的类别：组成型、诱导型和沉默型，并且碳青霉烯耐药水平及染色体β-内酰胺酶的表达在蜡样芽孢杆菌群的不同物种间存在显著差异。
RESULTS
物种和MLST
使用BTyper3系统的平均核苷酸一致性方法，将48株分离株分类为三个不同物种：30株Bacillus mosaicus、9株Bacillus cereus sensu stricto和9株Bacillus luti。所有B. cereus s.s.分离株被分类为panC群IV，所有B. luti分离株被分类为panC群V。B. mosaicus被分类为panC群II或III。
MLST分析显示，48株分离株分布在28个不同的序列型中。在9株B. luti分离株中，8株为ST151。在30株B. mosaicus分离株中，各有5株为ST167和ST3341，各有2株为ST3343、ST1050、ST1420和ST1425。在分析的30株B. mosaicus中，15株属于克隆复合体CC365。B. cereus s.s.的序列型各不相同，但有四株属于CC142。物种、MLST序列型、CC、panC系统发育群及其他详细基因组信息如图所示。
抗菌药物敏感性和修饰碳青霉烯灭活方法
氨苄青霉素和美罗培南的最小抑菌浓度及修饰碳青霉烯灭活方法结果如图所示。B. mosaicus和B. cereus s.s.对这两种抗生素的最小抑菌浓度分布广泛。相比之下，B. luti对两种β-内酰胺类药物均表现出持续较高的最小抑菌浓度值。
值得注意的是，尽管美罗培南最小抑菌浓度较高，但所有B. luti分离株使用修饰碳青霉烯灭活方法检测均为阴性。在其他两个物种中，7株B. mosaicus和2株B. cereus s.s.分离株显示修饰碳青霉烯灭活方法阳性结果。对于这两个物种，所有美罗培南最小抑菌浓度大于4 µg/mL的分离株均为修饰碳青霉烯灭活方法阳性。在分离株中，4株B. mosaicus和1株B. cereus s.s.的美罗培南最小抑菌浓度为2 µg/mL，其中2株B. mosaicus为修饰碳青霉烯灭活方法阳性。重要的是，所有最小抑菌浓度小于等于1 µg/mL的分离株均为修饰碳青霉烯灭活方法阴性。
各物种中β-内酰胺酶基因的存在
bla1基因存在于所有48株分离株中。bla1周围的遗传结构高度保守，sigma因子基因sigP和rsiP依次排列，下游是两种类型的青霉素结合蛋白和bla1。相比之下，bla1的下游区域表现出菌株特异性变异，不同的分离株中存在多样的遗传元件，如磷酸酯酶、乙酰转移酶和膜蛋白。
bla1的同源性在核苷酸水平为85%至99%，在氨基酸水平为84%至99%。相对于ATCC参考菌株，核苷酸同源性因物种而异。在B. cereus s.s.中，同源性范围为97%至99%；在B. luti中为91%至92%；在B. mosaicus中为85%至99%。
BcII基因在所有分析的B. cereus s.s.和B. mosaicus分离株中均被检测到。与bla1周围相对保守的区域相比，BcII周围的遗传结构显示出相当大的变异性。值得注意的是，sigma因子基因如sigP和rsiP在BcII附近缺失。相反，BcII周围的遗传区域，以及B. luti中相应的基因组位点，包含编码溶菌酶和羟胺还原酶的基因，以及几个功能未知的基因。
在B. mosaicus和B. cereus s.s.中，BcII似乎插入到B. luti中正向的溶菌酶基因和反向的假设蛋白之间。B. luti的遗传结构如图所示，19株B. mosaicus的遗传结构如图所示。在四株B. mosaicus分离株中，BcII下游存在一个IS605元件。此外，在七株B. mosaicus分离株中，紧邻BcII上游的溶菌酶基因缺失。
在B. cereus s.s.中，两株分离株保留了紧邻BcII上游的溶菌酶基因。其余七株B. cereus s.s.分离株中该溶菌酶基因缺失。本研究中所有细菌分离株均未显示与抗菌素耐药基因传播相关的遗传结构证据，如同源重组或转座子。
分离株间BcII的同源性在核苷酸水平为87%至100%，在氨基酸水平为86%至100%。BcII的核苷酸同源性在B. cereus s.s.中较高，范围为94%至100%。在B. mosaicus中，一株分离株显示99%的同源性，而其他分离株的同源性范围为87%至89%。每种β-内酰胺酶的同源性和结构的详细数据总结见表。
酶活性
本研究开发了一种新方法，用于测量革兰阳性菌中每单位质量蛋白质的β-内酰胺酶活性。该方法基于革兰阳性菌将产生的β-内酰胺酶释放到胞外环境。该技术包括离心液体培养基上清液以分离和定量对β-内酰胺抗生素的酶活性。除ATCC14579外，从血培养获得的48株临床分离株中选择了35株进行酶活性分析。对所有23株美罗培南最小抑菌浓度大于等于0.5 µg/mL的分离株评估了对青霉素G和美罗培南的酶活性。对于其余25株美罗培南最小抑菌浓度小于0.5 µg/mL的分离株，选择了12株子集以确保氨苄青霉素最小抑菌浓度值的平衡分布。
图显示了49株蜡样芽孢杆菌群分离株的系统发育树，以及药敏试验、修饰碳青霉烯灭活方法、酶活性和β-内酰胺酶基因的结果。
青霉素G
对青霉素G的酶活性如图所示。根据酶活性水平与头孢西丁诱导之间的关系，确定了三种调控系统类型：组成型、诱导型和沉默型。组成型组定义为无头孢西丁诱导时对青霉素G的酶活性大于50 U/mg的分离株。其他两组的酶活性小于10 U/mg。诱导型组在头孢西丁诱导后酶活性增加超过五倍，而沉默型组在诱导后酶活性未显著增加。
除三株B. mosaicus分离株和一株B. cereus s.s.分离株外，所有B. luti分离株均包含在组成型组中。大多数B. mosaicus和B. cereus s.s.分离株包含在诱导型组中，三株B. mosaicus分离株和两株B. cereus s.s.分离株包含在沉默型组中。
美罗培南
对美罗培南的酶活性如图所示。值得注意的是，所有B. luti分离株活性低且不被头孢西丁诱导，这与它们缺乏金属β-内酰胺酶一致。组成型组中的B. mosaicus和B. cereus s.s.分离株对美罗培南和青霉素G也表现出高酶活性。
在诱导型组中，18株分离株中的13株显示出对美罗培南和青霉素G的诱导活性。对于诱导型组中剩余的五株分离株，美罗培南酶活性未被头孢西丁诱导。在13株具有诱导性β-内酰胺酶活性的分离株中，选择NR5416作为代表性菌株，并使用肉汤微量稀释法和纸片扩散法评估头孢西丁的存在是否影响美罗培南耐药性。美罗培南的最小抑菌浓度最初为0.06 µg/mL。在头孢西丁存在下，美罗培南的最小抑菌浓度增加至1 µg/mL。随后，使用10 µg美罗培南和10 µg头孢西丁纸片在MH琼脂平板上进行纸片扩散试验，纸片间距20 mm，孵育过夜。孵育后，靠近头孢西丁纸片的美罗培南纸片周围的抑菌圈变平，形成特征性的D形抑菌圈。
三株沉默型分离株对美罗培南的活性极低，但NR5374和NR5375显示出与组成型组相当的高水平美罗培南酶活性。
酶活性、抗菌药物敏感性和修饰碳青霉烯灭活方法的详细数据总结见表。所有修饰碳青霉烯灭活方法阳性分离株的美罗培南水解活性均超过0.09 U/mg，表明修饰碳青霉烯灭活方法准确反映了蜡样芽孢杆菌群分离株的碳青霉烯酶活性。
RT-qPCR
除ATCC14579菌株外，使用RT-qPCR对35株具有酶活性数据的分离株中的23株定量了bla1和BcII的表达水平。从三个酶活性组中各选择代表性分离株进行RT-qPCR分析。
RT-qPCR结果、β-内酰胺药敏谱、修饰碳青霉烯灭活方法结果和酶活性测量值总结于表1。在组成型组中，所有B. mosaicus和B. cereus s.s.分离株均组成型表达bla1和BcII，与头孢西丁诱导无关。相比之下，所有B. luti分离株均组成型表达bla1，但未检测到BcII表达。头孢西丁诱导后β-内酰胺酶基因表达的倍数变化范围为0.8至1.6，表明无显著变化。
诱导型分离株根据bla1和BcII表达的诱导模式分为两个不同的组。第一组表现出bla1和BcII的诱导表达。该组包括一株B. cereus s.s.分离株和四株B. mosaicus分离株。在这些分离株中，头孢西丁诱导导致bla1表达增加超过五倍。尽管BcII在基线条件下主要是沉默的，但其表达在诱导后急剧增加。相比之下，第二诱导型组由四株B. mosaicus分离株组成，这些菌株在头孢西丁作用下表现出升高的BcII表达水平，而bla1表达未被诱导。
在沉默型组中，尽管对青霉素G的酶活性较低，但bla1和BcII持续表达，且不被头孢西丁诱导。尽管NR5374和NR5375显示出高水平的美罗培南活性，但它们的BcII表达水平与具有最低美罗培南活性的三株沉默型分离株相当。
DISCUSSION
本研究为蜡样芽孢杆菌群临床分离株的物种和基因型分布提供了新的视角。此外，这是首个阐明蜡样芽孢杆菌群内不同物种间β-内酰胺耐药差异并确定β-内酰胺酶活性存在三种不同调控机制（组成型、诱导型和沉默型）的研究。
基因组分析
本研究中使用的48株分离株被分类为28种不同的序列型。先前研究已证明蜡样芽孢杆菌群内的遗传多样性。然而，也观察到了特定序列型的基因组积累。例如，ST1420是日本近期引起医院感染的蜡样芽孢杆菌群中的主要序列型。对NCBI数据库中191株蜡样芽孢杆菌严格意义分离株的全面基因组分析进一步揭示，克隆复合体CC142是全球蜡样芽孢杆菌群中最广泛的遗传簇。
在我们的研究中，八个新的序列型被提交至在线MLST数据库。属于B. luti的ST151是最常被鉴定的序列型；然而，大多数先前研究缺乏关于分离来源或地理分布的详细信息。CC142是B. cereus s.s.中最普遍的簇，与先前报告一致，CC365是B. mosaicus中最常检测到的遗传簇。由于本研究基于日本单一中心的数据，结果不能直接推广到其他医院或地区。尽管如此，这些结果表明特定物种或序列型参与了人类感染。
基因组分析揭示了金属β-内酰胺酶在物种间的独特分布。所有B. mosaicus和B. cereus s.s.分离株携带BcII，而所有B. luti分离株缺乏该基因。这种完全分离表明BcII分布存在物种特异性差异。
迄今为止，已有15个B. luti的全基因组组装存入NCBI数据库，其中没有一个包含BcII基因。意大利的一项研究分析了17株血培养分离株，所有这些菌株都与B. cereus s.s.或苏云金芽孢杆菌密切相关，并且携带BcII基因。另一项研究发现，85株环境分离株中的76株含有BcII基因。在缺乏BcII的九株分离株中，五株被鉴定为假真菌样芽孢杆菌，三株为蜡样芽孢杆菌严格意义，一株为B. mosaicus。将我们的发现与先前报告整合表明，B. luti本身不拥有BcII，而蜡样芽孢杆菌群中大多数其他物种可能携带BcII。
考虑到本研究中确定的遗传特征，特别是BcII周围结构的物种特异性变异表明，使用诸如PCR检测等方法可能开发出改进的物种分化策略。目前，蜡样芽孢杆菌群的准确鉴定需要全基因组测序。开发简化的物种鉴定方法将极大提高快速微生物分类的效率。我们计划进行进一步研究，重点是扩大菌株收集、完善数据集并推进快速检测方法的开发。
最小抑菌浓度分布和修饰碳青霉烯灭活方法
由于存在染色体编码的β-内酰胺酶，蜡样芽孢杆菌群对青霉素和头孢菌素类β-内酰胺抗生素具有固有耐药性。碳青霉烯是治疗该物种引起感染的重要治疗剂；然而，关于蜡样芽孢杆菌群内物种碳青霉烯敏感性的数据有限。
据我们所知，本研究首次证明蜡样芽孢杆菌群内不同物种的碳青霉烯敏感率和碳青霉烯耐药机制存在差异，并且仅存在BcII并不是碳青霉烯耐药的可靠指标。
值得注意的是，在本研究中，B. luti分离株在三个物种中表现出最高的美罗培南最小抑菌浓度，尽管缺乏BcII基因。所有B. luti分离株修饰碳青霉烯灭活方法检测为阴性，与未检测到碳青霉烯酶活性一致。这些发现表明，B. luti中的碳青霉烯耐药是由碳青霉烯酶产生以外的机制介导的。
迄今为止，尚未有全面研究关注蜡样芽孢杆菌群中非β-内酰胺酶介导的碳青霉烯耐药机制。通常，与β-内酰胺耐药相关的修饰青霉素结合蛋白在革兰阳性菌中比在革兰阴性菌中更常见。革兰阳性菌，包括肺炎链球菌、口腔链球菌和屎肠球菌，由于青霉素结合蛋白对这些抗生素的亲和力降低而对碳青霉烯耐药。青霉素结合蛋白的改变是蜡样芽孢杆菌群近缘物种枯草芽孢杆菌青霉素耐药的原因。外排泵与蜡样芽孢杆菌群中某些分离株对β-内酰胺抗生素（包括氨苄青霉素和头孢呋辛）的耐药有关。尽管这仍是未来研究的主题，但B. luti特异性机制，如青霉素结合蛋白突变或主动外排泵的参与，可能有助于碳青霉烯耐药。需要包括更多临床分离株的进一步研究来阐明蜡样芽孢杆菌群内碳青霉烯耐药的物种特异性机制。
另外两个物种，B. mosaicus和B. cereus s.s.，都含有BcII，并且美罗培南的最小抑菌浓度范围很广。具有较高美罗培南最小抑菌浓度的分离株修饰碳青霉烯灭活方法阳性，这表明在这两个物种中，碳青霉烯耐药可能是由碳青霉烯酶产生引起的。修饰碳青霉烯灭活方法最初是为检测肠杆菌科和铜绿假单胞菌中的碳青霉烯酶产生而开发的，其适用于其他细菌物种的情况尚不清楚。然而，我们的研究表明，在蜡样芽孢杆菌群中，修饰碳青霉烯灭活方法可能是预测具有升高美罗培南最小抑菌浓度的分离株产生碳青霉烯酶的有用工具。在碳青霉烯耐药分离株中，该方法可用于区分缺乏BcII的B. luti与携带金属β-内酰胺酶的其他物种。
酶类别和RT-qPCR
在本研究中，使用新开发的方法成功测量了蜡样芽孢杆菌群中的β-内酰胺酶活性。通过浓缩粗酶提取物，能够准确评估酶活性。不浓缩则无法可靠测定活性值，可能是由于蛋白质浓度低所致。在革兰阴性杆菌中，酶活性通常在超声处理后评估；然而，在蜡样芽孢杆菌群中，超声处理与未超声处理样品相比没有产生显著差异。这种现象可能归因于革兰阳性菌将β-内酰胺酶分泌到胞外环境的特性。在头孢西丁诱导前后，单个诱导型分离株的酶活性与β-内酰胺酶基因表达水平之间观察到正相关，这表明本研究中开发的酶活性测定是定量β-内酰胺酶活性的可靠方法。需要进一步研究以评估该测定法对其他革兰阳性细菌物种的适用性。
这是首个在蜡样芽孢杆菌群物种中鉴定出三种不同β-内酰胺酶活性类型的研究：组成型、诱导型和沉默型。在组成型组中，所有B. luti分离株及几株B. mosaicus和B. cereus s.s.分离株在没有头孢西丁诱导的情况下对青霉素G表现出高酶活性，这表明该组组成型产生β-内酰胺酶。与酶活性结果一致，β-内酰胺酶基因在该组中组成型表达。在沉默型组中，除两株B. mosaicus和B. cereus s.s.分离株外，均表现出持续低酶活性，且活性不被头孢西丁暴露诱导。
在诱导型组中，基线条件下对青霉素G和美罗培南的β-内酰胺酶活性几乎检测不到，但头孢西丁显著诱导了该活性，并上调了bla1和BcII的转录。在NR5416中，美罗培南的最小抑菌浓度在头孢西丁存在下从0.06 µg/mL增加至1.0 µg/mL，并且当美罗培南纸片放置在头孢西丁纸片附近时，产生了D形抑菌圈。类似现象已在肠杆菌目中有报道，其中双纸片协同试验显示某些β-内酰胺类药物可诱导β-内酰胺酶表达，导致附近β-内酰胺纸片周围抑菌圈变平。在NR5416中观察到的双纸片结果提供了金属β-内酰胺酶诱导能力的视觉证据。
本研究中观察到的酶活性三联模式可能源于ECF sigma因子的参与。蜡样芽孢杆菌群的β-内酰胺酶活性受ECF sigma因子调控，包括SigP及其相关的抗sigma因子RsiP。RsiP的降解触发SigP激活，随后驱动bla基因的转录。β-内酰胺抗生素如头孢西丁已被证明可促进RsiP降解和SigP激活，导致β-内酰胺酶表达增加。先前研究报道，rsiP中的突变可影响β-内酰胺酶活性。一项研究中，rsiP的缬氨酸82或丝氨酸84被色氨酸取代的计算机模拟消除了预测的切割位点并阻止了SigP激活，而丝氨酸84被丙氨酸取代则显著增加了信号肽酶切割的预测概率，导致组成型SigP活性。另一项研究发现，在一株青霉素耐药的炭疽芽孢杆菌分离株中，由于基因组突变，RsiP被截短，使其无法隔离同源SigP。因此，SigP保持持续激活，导致bla基因的组成型表达。这些先前的发现表明，SigP/RsiP调控系统在调节β-内酰胺酶的酶活性中起关键作用。
在我们的研究中，所有分离株都含有与sigP/rsiP对应的同源物。然而，未发现可区分组成型、诱导型或沉默型β-内酰胺酶活性表型的特定突变。具体而言，没有分离株在缬氨酸82或丝氨酸84处携带突变，
