ABSTRACT
Vibrio natriegens 作为一种新兴的细菌平台，因其快速生长和易于遗传操作的特点，在生物技术应用中展现出巨大潜力。尽管对其好氧生理已有较多研究，但其厌氧发酵生理特性在工业相关条件下仍知之甚少。本研究比较了V. natriegens 与另一种生物技术相关细菌Escherichia coli 在发酵条件下的代谢参数。两种菌排泄了相似的发酵产物阵列，但V. natriegens 消耗的葡萄糖更少，产物滴度更低。V. natriegens 还表现出快速死亡，在生长阶段后12小时内灭绝，比E. coli 早3天。通过增加生长培养基的缓冲能力，可以避免V. natriegens 的快速死亡，并改善葡萄糖消耗和产物滴度，这表明V. natriegens 对其有机酸发酵产物相对敏感。除了RpoS在耐酸性中的次要作用外，V. natriegens 基因组缺乏几乎所有在E. coli 和Vibrio cholerae 中表征过的酸抵抗基因。因此，我们的发现强调了在设计V. natriegens 的发酵应用时需要考虑其酸敏感性。
IMPORTANCE
生物加工（Bioprocessing），即将可再生资源生物转化为增值化学品，有望满足对石油基产品可持续替代品日益增长的需求。许多生物加工实例采用缺氧发酵，自然最大化产物形成相对于微生物催化剂的生长。Vibrio natriegens 是一种兼性发酵细菌，因其快速生长速率和易于基因工程而受到生物加工领域的关注。然而，V. natriegens 的发酵特性尚未与传统的生物加工主力如Escherichia coli 进行比较。我们揭示了V. natriegens 对其自身酸性发酵产物相对敏感，可能是因为V. natriegens 缺乏E. coli 所具有的酸抵抗机制。因此，发酵应用必须通过缓冲发酵、工程化抵抗机制或通过工程化V. natriegens 生产中性产物来规避这种敏感性。
INTRODUCTION
生物加工利用天然或工程化的微生物从可再生资源产生增值产品，为石油基对应物提供可持续替代品。多种微生物已被提议作为生物加工的平台或底盘。海洋细菌Vibrio natriegens 因其快速生长和代谢以及通过自然转化易于进行组合遗传学而日益受到作为生物加工底盘的关注。概念验证研究已证明V. natriegens 可以被工程化以从一系列碳底物生产多种增值产品。然而，尽管许多生物过程使用缺氧发酵条件以最大化产物产量和最小化微生物生长，但大多数V. natriegens 研究使用有氧条件，仅有少数例外。
在缺氧条件和葡萄糖存在下，V. natriegens 进行混合酸发酵，排泄乙醇和各种有机酸。有机酸的积累会使培养基酸化。通常，酸应激对代谢和活力产生负面影响。当低pH有利于排泄的有机酸质子化，允许它们扩散到细胞质中，然后解离，酸化细胞质，削弱质子动力，并增加细胞质阴离子浓度时，酸性环境的负面影响会被放大。即使在有氧条件下，V. natriegens 的生长也受到因溢出代谢积累的乙酸引起的酸化的影响。因此，预计这些负面影响在有机酸积累更多的缺氧发酵条件下会加剧。了解V. natriegens 如何响应其发酵产物对于设计未来的生物过程很重要，因为有机酸影响重要的生产参数，包括速率、发酵时间、产量以及中和和废物处理的相关成本。
虽然其他弧菌如V. cholerae 可以响应酸性条件转换为中性发酵产物，但尚未观察到V. natriegens 产生中性发酵产物。发酵细菌如E. coli 有其他机制来处理酸应激。例如，E. coli 可以通过使用甲酸氢裂解酶（FHL）将甲酸转化为H2 和CO2 气体来抵消酸中毒。在特定氨基酸存在下，E. coli 和V. cholerae 也可以通过氨基酸脱羧反应消除细胞质质子。随着发酵过程中培养基酸化，E. coli 也将其发酵谱转向乳酸，这可能通过产生单一酸而不是乙酸和甲酸的组合来抵消酸中毒，并避免细胞内乙酸阴离子的积累。E. coli 对有机酸如乙酸、甲酸和乳酸也有不同的全局调控响应。V. natriegens 在混合酸发酵过程中使用这些或其他酸抵抗机制的程度尚不清楚。
本研究比较了V. natriegens 与E. coli 在缺氧发酵条件下的生长和代谢参数。尽管两种生物产生相似的发酵产物，但E. coli 培养物消耗更多葡萄糖，积累更多有机酸，并表现出更长的稳定期活力。我们得出结论，V. natriegens 由于缺乏酸抵抗机制，对发酵有机酸相对敏感。
RESULTS AND DISCUSSION
V. natriegens and E. coli have similar fermentative product yields
V. natriegens 常被与合成生物学中成熟的细菌E. coli 比较，作为生物加工的潜在平台。然而，尚未有发酵条件下生长和代谢参数的直接比较报告。我们在各自缺氧最小培养基中以25 mM葡萄糖作为唯一碳源培养E. coli MG1655和V. natriegens ATCC14048。培养基差异在于V. natriegens 的NaCl浓度更高，以及温度；E. coli 使用37°C，而V. natriegens 使用30°C。尽管最初报道V. natriegens 在37°C生长快约1.06倍，但几个小组在30°C培养V. natriegens ，包括与E. coli 的比较，其中在30°C下V. natriegens 的蛋白质生产优势已被注意到。尽管生长温度较低，V. natriegens 的生长速度比E. coli 快1.3倍。虽然V. natriegens 达到更高的浊度（OD660 ），但E. coli 具有更高的菌落形成单位（CFU）mL−1 ：OD660 比率，因此估计实际细胞密度（CFU mL−1 ）比V. natriegens 高1.2倍。
晚期稳定期（36小时）发酵产物产量在E. coli 和V. natriegens 之间要么统计相似，要么对最丰富的发酵产物表现出微小差异：甲酸，无差异；乙醇，无差异；乳酸，V. natriegens 高1.06倍；乙酸，E. coli 高1.20倍。两种菌在退出指数期时都产生乳酸，并持续生产到稳定期。次要发酵产物浓度和产量的倍数差异更大：E. coli 产生约1.3 mM琥珀酸，而V. natriegens 的水平接近检测限；V. natriegens 产生约1.7 mM丙酮酸，在上清液中稳定，而E. coli 瞬时产生高达0.8 mM丙酮酸；E. coli 产生约0.8 mM α-酮戊二酸，而V. natriegens 上清液中未检测到。另一个关键差异是V. natriegens 不产生H2 ，而已知E. coli 在pH降至中性以下时通过FHL产生H2 ；V. natriegens 基因组不编码FHL nor任何氢化酶。碳平衡分析显示，除了发酵产物和生物质之外，只有5 ± 1%（E. coli ）和6 ± 2%（V. natriegens ）的碳未被计入。缺失的碳部分可由氨基酸解释；Hoffart等人发现，细胞外丙氨酸、缬氨酸和谷氨酸可占V. natriegens 在发酵条件下消耗的葡萄糖碳的4%。
V. natriegens is more sensitive to acid than E. coli
两种菌株均未完全消耗提供的葡萄糖，但E. coli 消耗的葡萄糖比V. natriegens 多1.2倍。一个可能的原因是每种菌都达到了其酸耐受阈值，而V. natriegens 的酸耐受性较低。确实，尽管每种菌的总有机酸产量相似，但E. coli 积累了1.2倍更多的有机酸和1.3倍更多的每细胞有机酸。结果，最终E. coli 的pH更酸性，为4.8 ± 0.0，而V. natriegens 为5.2 ± 0.0。
为了比较两种菌的酸耐受性，我们在稳定期通过CFU跟踪细胞活力。在此，我们假设CFU下降等同于死亡，特别是在酸性条件下，但我们承认也存在可行但不可培养（VBNC）状态的可能性，正如其他弧菌中所描述的那样。然而，虽然VBNC状态对流行病学很重要，但由于其缺乏代谢活性，VBNC细胞对增值化学品生产没有实际用途。尽管从浊度测量中未明显看到死亡，但CFU测量表明两种菌最终都灭绝了。然而，虽然可存活的E. coli 细胞在接种后最多82小时被检测到，但在接种后24小时（检测限=102 CFU mL−1 ）未检测到可存活的V. natriegens 细胞，大约在指数生长阶段结束后12小时。
为了验证有机酸是V. natriegens 细胞死亡的主要驱动因素，我们将晚期指数期培养物接种到缺乏葡萄糖但含有不同浓度1:1乙酸和甲酸混合物的培养基中。用于制备这些悬浮液的培养物使用较少的葡萄糖（15 mM）生长，以确保在测定前减少酸暴露。在没有添加有机酸的情况下，两种菌都显示出很少的活力下降。E. coli 的活力也不受20和40 mM有机酸的影响。相比之下，增加有机酸浓度逐渐降低V. natriegens 的活力并增加死亡率。
然后，我们通过用100或200 mM 4-吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲液增加培养基的缓冲能力来验证V. natriegens 对有机酸的敏感性取决于pH。在每种情况下，在稳定期开始时活细胞计数均超过108 CFU mL−1 。与排除MOPS时观察到的快速灭绝不同，100 mM MOPS将灭绝延迟了24小时，而200 mM MOPS在100小时的时间过程中避免了灭绝。即使使用100 mM MOPS细胞仍然灭绝，但葡萄糖在24小时前被完全消耗，大多数发酵产物持续生产，尤其是乳酸。最终pH也相应地更高，正如预期的那样。因此，我们得出结论，V. natriegens 在发酵培养物达到稳定期后的快速灭绝是由于酸敏感性。
V. natriegens lacks acid resistance mechanisms
我们寻求解释V. natriegens 和E. coli 在酸性条件下存活的显著差异。像E. coli 和一些充分表征的弧菌，如V. cholerae ，有机制来处理发酵过程中的酸应激以及通过高度酸性的胃。为了确定V. natriegens 的酸抵抗库，我们使用已知的E. coli 和V. cholerae 酸抵抗蛋白作为查询序列进行了BLASTp搜索。我们专注于涉及细胞包膜应激和特定酸响应机制的机制。我们排除了其他在功能基因组调查中出现但通常被大多数细菌在各种条件下使用的蛋白质。
基于我们超过50%查询序列具有25%同一性的同源阈值标准，V. natriegens 可能具有几种响应细胞包膜应激的蛋白质，这可能包括酸应激，但也包括其他应激源，如热。例如，V. natriegens 具有与V. cholerae 转录调节因子ToxR和孔蛋白OmpU分别具有53%和65%氨基酸同一性的蛋白质。这些蛋白质参与V. cholerae 在低pH下对有机酸的耐受，但也可以响应其他应激源。V. natriegens 还具有与E. coli LPS修饰酶具有55%和63%氨基酸同一性的蛋白质，这些酶被证明可以提高酸耐受性。我们还鉴定了一个σE 同源物及相关蛋白质，在E. coli 中，它们激活一个调节子以响应变性外膜蛋白，以及Cpx双组分系统，响应周质和内膜应激信号。在E. coli Cpx调节子的基因中，V. natriegens 也有cfa ，它编码一种产生环丙烷脂肪酸的蛋白质，可以保护 against various stressors, including acidity。然而，V. natriegens 似乎缺乏许多在E. coli 中对于在应激条件下正确折叠或降解细胞包膜蛋白质至关重要的伴侣蛋白和蛋白酶（即degP 、hdeABD 、skp ）。
当考虑对酸应激的特定响应时，V. natriegens 基因组表明其装备甚至更差。FHL，一种甲酸脱氢酶（FDH）和氢化酶的复合物，将甲酸转化为CO2 和H2 气体。虽然V. natriegens 有FDH蛋白质同源物，但V. natriegens 没有氢化酶基因。与这一生物信息学结果一致，通过气相色谱法在V. natriegens 发酵培养物中未检测到H2 。
为了处理有机酸重新进入细胞产生的阴离子积累，E. coli 可以积累K+ 。V. natriegens 有一个与E. coli TrkG或TrkH K+ 转运蛋白同源的蛋白质。然而，它只有一个与ATP依赖性K+ 转运蛋白一个亚基同源的蛋白质；V. cholerae 也缺乏这种转运蛋白。V. natriegens 还缺乏几种在E. coli 中响应急性酸应激的小蛋白质的同源物，以及一个与V. cholerae 调节磷酸转移酶vc1080 同源的蛋白质，虽然本身不是酸耐受蛋白，但被下调以避免甲酸毒性。
V. natriegens 还缺乏在E. coli 和V. cholerae 中都可以消除细胞质质子的氨基酸脱羧酶，但它有两个H+ /Cl- 逆向转运蛋白中的一个，这有助于在使用氨基酸脱羧酶期间防止膜过度极化。用于酸抵抗的氨基酸脱羧酶不同于合成代谢，需要外部氨基酸来源。因此，我们不期望氨基酸脱羧酶在我们不含氨基酸的最小培养基中有效。
在一些致病性E. coli 中，氨基酸脱羧酶可以由一般应激反应sigma因子RpoS调节。我们的V. natriegens 菌株有一个导致提前终止密码子的rpoS 突变（RpoSE71* ）。鉴于RpoS调节子广泛，我们决定研究该突变是否以其他方式影响V. natriegens 的酸耐受性。因此，我们修复了终止密码子以创建RpoS+菌株。然后，我们比较了RpoS+菌株与亲本在进入发酵条件下的稳定期后的存活情况。RpoS+活力的下降在达到稳定期时仍然严重，但死亡率不如亲本菌株明显，并且RpoS+群体在50小时内未达到灭绝（100–1,000 CFU mL−1 ）。因此，RpoS可能在V. natriegens 的酸耐受性中起作用，但无法达到与E. coli 相同水平的酸耐受性。
Lactic acid production prolongs growth and metabolism but does not improve survival
产生多种发酵产物的生物可以改变其发酵谱以响应环境条件。与V. cholerae 不同，V. natriegens 缺乏产生中性发酵产物的基因。然而，像E. coli 一样，V. natriegens 在晚期指数期和进入稳定期时产生乳酸。在E. coli 中，细胞质乳酸脱氢酶（LDH）表达响应酸性pH而增加，表明乳酸生产可能减少酸应激。向乳酸生产的转变而非乙酸生产也与致病性E. coli O157:H7相对于E. coli K-12菌株的存活增强相关，可能是通过避免细胞质乙酸阴离子的积累。转向乳酸生产将导致更少的ATP，但总体上酸更少以维持电子平衡；两个丙酮酸可以要么转化为两个乳酸（pKa, 3.86），要么转化为一个乙醇+ 2个甲酸（pKa, 3.75）+ 1个乙酸（pKa, 4.76）。后一路径将产生更多的有机酸，其中一种是乙酸，由于其高pKa，在低pH下更容易质子化。乙酸/乙酸根通常也可能比乳酸/乳酸根毒性更大。
为了测试乳酸生产是否有助于V. natriegens 在发酵条件下的存活，我们首先创建了一个LDH突变体。V. natriegens 有三个推定的LDH基因，PN96_RS20515，PN96_RS17000（dldh ），和PN96_RS17015（lldh ）。后两个基因已被另一个小组删除，对发酵乳酸生产影响很小。然而，该研究中的条件有利于琥珀酸生产而非乳酸生产，而我们观察到相反的情况。使用E. coli MG1655的发酵LDH基因（b1380）作为BLASTp查询，我们假设dldh 最可能是V. natriegens 的发酵LDH（100%覆盖率，62%同一性）；其他两个候选者与查询序列没有显著的序列同一性。确实，当我们删除V. natriegens dldh 时，乳酸产量在24小时时接近零。与亲本菌株相比，Δdldh 突变体产生多1.2倍的甲酸和多1.3倍的乙醇，这一途径将取代乳酸生产的电子平衡作用。Δdldh 突变体还产生多2.8倍的丙酮酸，表明在缺乏LDH的情况下产生了瓶颈。Δdldh 突变体消耗的葡萄糖比亲本少，这不影响生长速率，但最终Δdldh 突变体的浊度是亲本的90%。然而，总有机酸产量在两个菌株之间没有显著差异，表明即使没有乳酸生产，V. natriegens 也面临相当的酸暴露。
因此，我们检查了LDH缺失对V. natriegens 在发酵条件下稳定期存活的影响。预计快速死亡率会使比较分析变得困难，我们添加了100 mM MOPS以减缓死亡率。稳定期存活率在亲本和Δdldh 菌株之间相似。因此，虽然在缺乏MOPS的情况下，乳酸生产将葡萄糖消耗延长到稳定期，并可能允许更高的细胞密度，至少通过浊度测量，但在含有MOPS的发酵条件下，它并不能改善稳定期存活，其中野生型乳酸产量相对于其他发酵产物升高。
下面我们推测为什么在退出指数生长并进入稳定期的过渡期间可能产生乳酸。一种可能性是乙酸和乙醇生产作为一种选择变得不那么可用。例如，随着pH下降和生长减慢，对ATP的生物合成需求也会减慢。这可能会限制乙酸生产的ADP可用性，并在丙酮酸处产生瓶颈。LDH提供了一个碳和电子汇以维持代谢流并帮助缓解这一瓶颈；LDH在解决这一瓶颈中的作用也将解释Δdldh 突变体中丙酮酸排泄升高。如果我们假设与E. coli 酶相似的动力学参数，LDH可能准备好响应丙酮酸积累，因为其表达增加并且在低pH下对丙酮酸的半饱和常数相对于PFL有所改善。需要表征这些V. natriegens 酶的动力学特性来检验这一假设。
Conclusion
随着对V. natriegens 作为生物加工菌株的兴趣增长，必须权衡其快速生长和遗传易操作性的有利属性与其不太有利的属性。在此我们报告，相对于E. coli ，V. natriegens 对混合酸发酵过程中出现的酸性条件相对敏感。这种酸耐受性的差异可能是由于V. natriegens 缺乏大多数在E. coli 中表征过的酸抵抗机制。这些酸抵抗机制可能被工程化以改善V. natriegens 的酸耐受性。增加发酵培养基的缓冲能力也将避免酸敏感性，但需要在工业 条 件 下 权 衡
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