1. 引言
生物偶联化学领域近年来取得了显著进展，特别是在基于硫醇的动态、可逆偶联策略方面。半胱氨酸（Cys）因其高亲核性、天然丰度低且易于通过定点突变引入特定位点，成为极具吸引力的靶点。可逆硫醇偶联利用多种亲电支架和切割机制，包括迈克尔受体（如马来酰亚胺、烯酮、炔酮和丙烯酸酯）、1,2-加成系统（如氰基吡啶和亚氨基硼酸盐）、脂肪族亲电试剂（如苄基和α-卤代支架，经历SN2反应）、芳香族SNAr连接体、二硫键连接体以及硫醇-烯反应。这些策略在肽合成、肽订书、抗体-药物偶联物（ADCs）和响应性生物材料等应用中展现出巨大潜力。本综述旨在对过去15年（截至2024年）的文献进行批判性概述，重点讨论含硫醇连接体的最新发展，分析其化学基础、实际应用、当前局限性，并为设计选择性、生物相容性和功能动态的偶联平台提出未来方向。
2. 硫醇-迈克尔加成反应
硫醇-迈克尔加成是一种高效的点击反应，具有条件温和、产率高、选择性好等特点。该反应机理涉及亲核试剂（硫醇）与缺电子烯烃（迈克尔受体）的β-碳结合，形成碳负离子中间体，随后质子化或进一步官能化。反应速率受pH值影响显著，在生理或更高pH值下更快。该反应的可逆性（逆迈克尔反应）在碱性介质中尤为明显，为动态生物偶联提供了基础。
2.1. 马来酰亚胺基连接体
马来酰亚胺是半胱氨酸生物偶联的“主力”，具有反应速率快、选择性高、转化率高等优点。然而，硫醇-马来酰亚胺加合物在生理条件下可能发生逆迈克尔反应和硫醇交换反应，导致偶联物降解。为提高稳定性，研究人员开发了氮取代马来酰亚胺（如末端伯胺、季铵盐、芳基等）以调控水解速率。下一代马来酰亚胺（NGMs），如吡啶二酮（PDs）和5-亚甲基吡咯酮（5MPs），显示出对环水解的惰性，并能通过逆迈克尔或硫醇交换实现可控释放。
2.2. 烯酮、炔酮和丙烯酸酯
4-取代环戊烯酮等烯酮类化合物可用于半胱氨酸的特异性标记，其稳定性可通过结构调控。例如，4-乙酰氧基环戊烯酮与硫醇反应后经历快速β-消除，形成稳定的生物偶联物，仅在额外迈克尔供体存在下才可逆。线性α,β-不饱和羰基化合物（如炔酰胺、炔酮）则通过形成乙烯基硫醚键实现可逆偶联，其可裂解性受取代基电子效应影响。氰基丙烯酸酯类连接体因其强吸电子特性，易于发生逆迈克尔过程，在激酶抑制剂设计和光控肽折叠等领域有应用。此外，花青染料（如Cy5）在硫醇存在下可发生光诱导可逆加成，用于超分辨率显微成像。
2.3. 氧杂降冰片二烯（ODNs）
氧杂降冰片二烯（ODNs）通过狄尔斯-阿尔德反应合成，其缺电子碳碳双键对硫醇具有高反应性。ODNs加合物可通过逆狄尔斯-阿尔德（rDA）反应裂解，释放呋喃和硫代马来酸酯，实现可逆偶联。其稳定性受桥头取代基电子效应和氢键相互作用影响。ODNs已应用于蛋白质标记、药物释放和可降解水凝胶构建。其氮类似物（ZNDs）也显示出类似但更慢的环反转动力学。
3. 加成-消除反应
加成-消除反应涉及硫醇对缺电子烯烃的加成，随后消除离去基（LG），形成硫醚键。该键在生理条件下稳定，但可在过量硫醇存在下通过交换反应裂解。
3.1. 溴马来酰亚胺
溴马来酰亚胺通过硫醇加成和溴化物消除形成硫醚键。与马来酰亚胺相比，其加合物不易发生逆迈克尔反应，但可通过硫醇交换实现可逆性。该策略已用于蛋白质的可逆修饰和二硫键桥接。
3.2. 茚满二酮
茚满二酮类连接体（如IDA系列）与相邻二硫醇蛋白（VDPs）反应形成稳定加合物，其可逆性可通过还原剂（如DTT）触发。取代基的立体和电子效应影响加合物稳定性和交换速率。
3.3. 溴吡啶二酮
溴吡啶二酮（BrPDs）可选择性修饰半胱氨酸，形成水解稳定的加合物。单溴PDs用于单一位点修饰，而二溴PDs（diBrPDs）可用于二硫键重建，生成均质抗体偶联物（ADCs），具有良好的稳定性和药代动力学特性。
4. 1,2-加成反应
1,2-加成反应涉及硫醇对碳-杂原子多重键的亲核攻击，形成共价加合物。其可逆性受反应中心亲电性和加合物热力学稳定性调控。
4.1. α-取代腈
α-取代腈（如氰基苯并噻唑CBT）与半胱氨酸反应形成硫代亚胺酸酯中间体，该中间体可逆分解或发生分子内S→N转移形成稳定脒。该化学用于选择性肽修饰和催化肽连接（CPL）研究。
4.2. 亚氨基硼酸盐
亚氨基硼酸盐（如2-FPBA）与N-末端半胱氨酸缩合形成希夫碱，并通过分子内B-N配位稳定，形成噻唑烷硼酸酯（TzB）加合物。该反应在生理条件下快速、定量进行，可逆性具有pH依赖性。
4.3. 异噁唑啉酮
异噁唑啉酮衍生物通过银催化氧化环化生成，其C4位具有高亲电性，可与半胱氨酸发生1,2-加成。烷基化苯酰硫醚加合物在365 nm紫外光照射下可发生Norrish II型裂解，实现光控去偶联。
4.4. 三嗪
1,2,3-三嗪与半胱氨酸反应生成二氢三嗪中间体，随后消除氮气形成α,β-不饱和亚胺，后者可水解为醛。该加合物在过量谷胱甘肽（GSH）存在下可逆，释放原始硫醇。三嗪连接体允许二级和三级功能化，在肽和蛋白质修饰中具有应用价值。
5. 芳香亲核取代反应（SNAr）
SNAr反应涉及硫醇对芳香环的亲核攻击，形成σ-络合物，随后消除离去基。其反应速率受芳香支架电子性质和取代基强烈影响。
代表性例子包括吡啶鎓离子、四嗪和杂芳族唑啉硫醚。例如，N-甲基吡啶鎓离子与半胱氨酸反应速率可通过Hammett常数预测，其加合物在硫醇存在下可逆。四嗪类连接体还可进行逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（IEDDA），改变其反应性。杂芳族唑啉硫醚（HAT）可实现半胱氨酸标记，加合物可通过还原或碱性水解裂解，留下脱氢丙氨酸（DHA）用于进一步功能化。
6. 脂肪族亲核取代反应
脂肪族亲核取代依赖于硫醇对sp3杂化亲电碳中心的直接攻击。
6.1. 苄基卤化物
苄基卤化物（如香豆素、邻硝基苄基衍生物）可作为硫醇的光笼保护基。光照下发生C-S键异裂，释放游离硫醇。例如，硝基二苯并呋喃（NDBF）笼在365 nm或双光子激发下有效去保护，用于细胞内蛋白质功能研究。基于二甲基亚甲基蓝（bimane）的连接体在可见光（420 nm）下触发硫醇交换，实现可逆、无痕偶联。
6.2. α-卤代酰胺
α-氯氟乙酰胺（CFA）在半胱氨酸修饰中表现出中等反应性和部分可逆性。在溶剂暴露区域，加合物发生水解，再生游离硫醇；而在疏水口袋（如EGFR的ATP结合位点）中，加合物则高度稳定，实现了“选择性持久性”。
7. 硫醇-二硫键交换反应
硫醇-二硫键交换是生物学中重要的可逆过程，涉及硫醇对二硫键的亲核攻击，生成新的二硫键和硫醇盐。
应用包括使用2-硝基藜芦基（oNv）作为光裂解硫醇保护基，在肽合成中指导二硫键形成。N-炔硫基邻苯二甲酰亚胺作为有效的亲电硫转移试剂，在酸催化下将硫醇直接转化为二硫键。磺基硫代酸酯自焚连接体（SIL）可用于纳米抗体的位点特异性可逆修饰，实现药物递送和释放。
8. 自由基硫醇-烯反应
自由基硫醇-烯反应是一种点击化学，具有高化学选择性、快速动力学和生物相容性。反应由光或热引发，涉及硫基自由基对烯烃的加成，随后链转移再生硫基自由基。
Anseth等人开发了一种基于烯丙基硫醚的可逆系统，用于蛋白质在水凝胶中的图案化。硫醇-烯反应后，β-断裂再生烯丙基硫醚部分，允许迭代的拴系和释放。该系统可用于空间控制蛋白质呈现和监测细胞对信号蛋白（如TGF-β1）的反应。
9. 结论与未来展望
基于硫醇的动态生物偶联化学已成为化学生物学、材料科学和生物医学工程的核心工具。通过理性设计可逆和刺激响应连接体，实现了对生物分子结构和功能的精确控制。然而，在复杂生物环境中实现可预测和选择性裂解仍面临挑战，特别是在抗体偶联药物（ADCs）开发中，需要平衡动态行为与稳定性、安全性和重现性。未来研究将侧重于利用计算技术和机器学习设计新一代动态系统，改善反应性、生物相容性、位点选择性和可调裂解动力学，并探索其与生物正交反应、先进成像、精准医疗等前沿技术的结合，推动从概念验证到临床转化的进程。
