脑缺血再灌注损伤（CIRI）是缺血性脑卒中再灌注治疗（如静脉溶栓、动脉取栓）后发生的一种严重继发性损伤，显著影响了患者的预后。其核心病理机制在于再灌注过程中爆发性产生的活性氧物种（ROS）和活性氮物种（RNS）打破了细胞内的氧化还原稳态，引发氧化应激，最终导致神经元死亡。同时，作为还原性物质的活性硫物种（RSS），如谷胱甘肽（GSH），在对抗氧化损伤、维持平衡中扮演着关键角色。因此，实时、原位监测大脑内ROS/RSS水平及微环境的动态变化，对于揭示CIRI机制和开发干预策略至关重要。然而，传统检测方法难以实现活体、无损的实时观测，而有机小分子荧光探针以其操作简便、高灵敏度、高时空分辨率和实时监测能力，成为攻克这一难题的理想工具。本文综述了近五年来该领域的研究进展。
单生物标记物激活型荧光探针的开发及其在CIRI研究中的应用
针对CIRI过程中特异性变化的生物分子，研究者们开发了多种“单靶点”激活型荧光探针。
过氧化氢（H2O2）的特异性位点识别
H2O2是关键的ROS之一，其水平异常与多种脑部疾病相关。硼酸酯基团因其对H2O2的高特异性亲核反应而被广泛用作识别单元。例如，基于活性传感与标记串联策略的探针1，利用罗丹明荧光团和硼酸酯，不仅实现了对H2O2的成像，还能通过共价标记永久记录其信号，成功可视化了小胶质细胞-神经元共培养模型中细胞间的H2O2信号传导。探针2则结合了吡嗪酮荧光团和酰基硼酸盐响应位点，具备双光子特性和强大的血脑屏障（BBB）穿透能力，能够以比率荧光模式超灵敏地检测小鼠大脑早期CIRI过程中产生的H22。为了克服其他ROS（尤其是ONOO–）的干扰，探针3采用了双活化策略，通过引入一个亲电双键位点，让氧化性更强的ONOO–优先攻击此处，从而保障了对H2O2的特异性识别。此外，基于化学发光原理的探针5，利用串联Payne/Dakin反应机制，无需激发光即可实现高信噪比的活体成像，首次在大鼠CIRI模型中可视化显示了H2O2的动态变化。
次氯酸（HClO）、羟基自由基（·OH）和过氧亚硝酸盐（ONOO–）的特异性荧光识别
线粒体是ROS的主要来源，其功能障碍与CIRI密切相关。近红外探针6以酰肼为HClO识别单元，以吡啶阳离子为线粒体靶向基团，实现了对CIRI小鼠大脑中HClO水平的灵敏成像和定量评估。·OH作为最具破坏性的ROS，其检测极具挑战。基于氢原子转移（HAT）机制的探针7，凭借精确可调的激活能力和优异的BBB通透性，首次在大鼠CIRI模型中实现了·OH的高时空分辨率原位可视化。
ONOO–是硝化应激的关键标志物，在CIRI的血管和神经元损伤中起重要作用。探针8基于苯-BODIPY荧光团和对羟基苯胺识别单元，具有良好的脂水分配平衡，能高效穿透BBB并在小鼠脑中富集，成功成像血栓形成和早期缺血阶段过量的ONOO–生成。探针9和比率型探针10则分别基于吲哚-2,3-二酮衍生物的环化重组机制和通过键能量转移（TBET）机制，实现了对脑血管和细胞OGD/R（氧糖剥夺/复氧）模型中ONOOsup>–爆发的高选择性、快速响应成像。更有趣的是，探针11采用了一种协同机制：在被ONOO–触发释放荧光的同时，还会释放出一氧化碳（CO），后者可能发挥抗氧化保护作用，为缺血性卒中的治疗提供了新思路。近红外探针12和13则分别针对大脑和內质网（ER）中的ONOO–进行了优化设计，前者具有高BBB穿透率，后者则实现了对ER中亚硝化应激的特异性靶向成像。此外，作为氧化应激“分子标尺”的超氧阴离子（O2•–）也备受关注。探针14和15基于分子内电荷转移（ICT）机制，通过筛选获得了优异的BBB穿透性和线粒体靶向能力，成功实现了对大鼠CIRI模型中O2•–水平升高的清晰可视化。
生物硫醇（RSS）的特异性识别
生物硫醇如谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy）是重要的内源性抗氧化剂。近红外探针16利用二硒键作为GSH响应单元，通过硒-硫交换反应和分子内环化释放荧光，成功捕获了CIRI过程中神经元线粒体内GSH水平的动态变化，揭示了GSH通过调节ROS诱导的线粒体凋亡通路发挥保护作用。基于“点击”开环和“自焚”机制的探针17、18则实现了对生物硫醇的快速近红外检测，并观察到其在CIRI过程中的先升后降的动态变化。探针19基于BODIPY荧光团和2,4-二硝基苯磺酸识别单元，在响应GSH时还能可控释放二氧化硫，其两亲性修饰大大增强了BBB穿透性，实现了对脑损伤后低浓度GSH的高分辨监测。通过比较二硫键和二硒键，研究发现线性二硒键可通过ICT和荧光共振能量转移（FRET）的协同作用实现更高效的荧光猝灭，基于此设计的探针20-2具备双光子特性，能快速成像中风小鼠脑中硫醇水平的恢复过程。为了区分结构相似的Cys、GSH和Hcy，双位点探针21利用BODIPY框架上两个氯原子的差异化反应动力学，成功实现了对Hcy的选择性比率检测，并首次提供了Hcy代谢与CIRI神经元损伤直接关联的实验证据。研究还发现，CIRI患者血液中Hcy水平常升高，而维生素B12的疗效可能受溶酶体中脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）的影响。溶酶体靶向探针22首次在活体小鼠脑内检测到CIRI条件下溶酶体MDA的显著升高，并证实过量的溶酶体MDA会阻碍维生素B12从溶酶体向细胞质的转运，这为理解Hcy代谢障碍提供了新视角。
酶的特异性识别
硫氧还蛋白还原酶（TrxR）是维持细胞氧化还原稳态的关键含硒酶。双光子探针23以1,2-二硫戊环为TrxR识别单元，首次在CIRI小鼠脑内观察到了TrxR功能的丧失，建立了中风与TrxR功能障碍的机制联系。针对线粒体亚型TrxR2设计的比率型双光子探针24，通过引入吡啶基团增强了与酶活性位点的结合，成功可视化显示了小鼠中风模型中TrxR2活性的下降。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD(P)H）作为细胞代谢的核心辅酶，其水平与脑功能及多种神经疾病密切相关。线粒体靶向探针25能够响应NAD(P)H的还原，其还原产物NADH-RH还能从线粒体易位至细胞核，实现了对线粒体NAD(P)H动态和核形态变化的同步观察，并在CIRI小鼠模型中检测到NAD(P)H水平的显著降低。
微环境协同型荧光探针的开发及其在CIRI中的应用
CIRI的病理过程不仅涉及特定分子变化，还伴随微环境参数的改变，如自噬过程中的酸性pH和线粒体功能障碍相关的粘度增加。
pH的协同效应
自噬过程伴随着ONOO–爆发和后期自噬溶酶体酸性环境的形成。探针26基于这一病理通路特征设计：首先被早期自噬产生的ONOO–氧化激活，转化为中间态荧光；随后，该中间态在后期自噬的酸性环境中质子化，荧光进一步增强。这种双激活机制实现了对活细胞和小鼠血管内皮损伤过程中自噬流的高时空分辨率监测。
粘度的协同效应
线粒体粘度是反映其功能状态的重要物理参数。溶酶体靶向探针27基于扭曲的分子内电荷转移（TICT）机制，粘度增高会限制分子内旋转，从而增强荧光，该探针被用于实时监测CIRI诱导的氧化应激模型中的自噬水平。双功能探针28则能同时、独立地检测线粒体粘度和O2•–：粘度响应通道基于分子旋转受限，O2•–响应通道则基于对二苯基膦酸吡啶鎓片段的亲核攻击和1,6-消除反应。应用该探针发现，CIRI过程中线粒体O2•–过量产生与粘度增加相关。为了同时研究线粒体粘度和H2O2的相关性，探针29采用了D-π-A结构，并进行了两亲性和线粒体靶向修饰，成功应用于OGD/R细胞模型和CIRI大鼠模型的同步成像。基于激发态分子内质子转移（ESIPT）机制的近红外探针30，具有大斯托克斯位移和优异的BBB穿透性，能够实时可视化大脑中的氧化应激动态，并证实了抗氧化剂阿扑吗啡（APO）的神经保护作用。
结论与展望
综上所述，有机小分子荧光探针已成为揭示CIRI氧化还原失衡机制不可或缺的强大工具。通过整合特异性响应基团、靶向修饰和微环境响应单元，这些探针实现了对ROS、RSS、酶活性及微环境参数的高精度、实时、活体成像。未来，该领域的发展需应对个体差异、体内分布可控性、复杂微环境适应性、临床转化瓶颈等挑战。通过跨学科融合，结合人工智能进行分子设计和新材料筛选，以及发展集诊断与治疗于一体的诊疗一体化平台，有望推动荧光探针技术在脑疾病机制研究和临床诊疗中发挥更大作用。
