1 引言
合成肽因其高效力和特异性调控生物过程的能力，已成为一类重要的治疗剂。通过固相肽合成（SPPS）技术，能够快速组装复杂的肽序列。然而，SPPS过程中可能产生多种结构紧密相关的杂质，如脱酰胺、异天冬氨酸变体、链截断或缺失以及氨基酸误掺等。这些杂质即使含量微小，也可能显著影响肽的功能与特性，因此需要精准的杂质分析和可靠的纯化策略。高效液相色谱（HPLC）是分离和测定合成肽纯度的首选分析方法。尽管存在如亲水相互作用色谱（HILIC）和超临界流体色谱（SFC）等其他模式，但使用C4、C8或C18固定相的反相液相色谱（RPLC）因其出色的分辨能力、仪器简单性、稳健性和多功能性而成为应用最广泛的技术。在肽生产工作流程中，制备纯化常使用反相快速液相色谱（RP-FPLC）系统。然而，尽管与HPLC有概念上的相似性，色谱信息在这些系统间的转移仍然具有挑战性。色谱柱几何形状、固定相粒径、系统死体积、梯度延迟和整体系统分散性的差异会显著改变保留行为和洗脱时间，导致根据分析型HPLC预测的洗脱条件往往无法在制备型FPLC系统上重现等效的选择性或分辨率。本研究旨在通过系统性评估影响肽分离和纯化的色谱参数，解决肽驱动药物发现项目中的分析挑战。
2 材料与方法
2.1 文库生成与杂质类别定义
研究合成了一个包含23种肽的文库，其中包括五种目标肽（P1, P7, P11, P16, P20）以及一系列精心设计的、代表常见合成相关杂质的结构类似肽。这些杂质被分为七个类别，反映了常见的杂质模式，例如脱酰胺、异天冬氨酸形成、亮氨酸/异亮氨酸异构体以及缺失产物。所有肽均通过标准Fmoc固相肽合成法制备。肽的纯度分析使用配备UV检测器的VWR ELITE Lachrom Series LC系统，在Sunfire C18柱上进行。流动相为含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈（ACN，A液）和含0.1% TFA的水（B液）。梯度程序、流速、柱温等条件均有详细规定。
2.2 通过HPLC-UV识别关键参数
为确定对可靠纯度测定最关键的分析参数，研究进行了一系列色谱柱和方法筛选实验。评估了三根10 μm粒径的筛选柱与两根分析参比柱（3.5 μm和5 μm粒径）的性能。使用截短后的梯度方法进行比较。此外，还系统研究了梯度陡度、流速、柱温和流动相改性剂作为关键变量的影响。色谱性能基于三个标准进行评估：特定杂质组内所有肽物种作为独立色谱峰的完全可检测性、理论塔板数（N）以及色谱分辨率（Rs）。
2.3 将HPLC结果转移至FPLC
为校正HPLC-to-FPLC方法转移过程中系统特异性差异，研究开发了一个校正方程，通过将观察到的保留时间（Rₜ）扣除系统延迟时间（包括柱体积和滞留体积）来计算FPLC洗脱点的有效ACN百分比。该方程考虑了梯度斜率、起始ACN浓度、柱体积除以流速的时间以及HPLC系统滞留体积除以流速的时间。为验证该校正方程，选取了六种肽（P8–P10和P17–P19）在上述FPLC系统上进行重新纯化。将由此得到的溶剂组成与HPLC洗脱组成以及校正后的数值进行比较，以确定校正方程的准确性。
2.4 加标杂质组与纯化性能评估
在研究的最后部分，通过加注定量的代表特定杂质组的肽混合物，重新创建了选定的杂质组，以评估优化后的分离参数及其向FPLC转移的适用性。制备了杂质组1–4和6。加标组使用前述FPLC条件进行纯化。通过收集组分的重量测定回收率，并通过LC-UV面积归一化法测定纯化后肽的纯度。
3 结果与讨论
3.1 色谱柱类型、梯度陡度与方法缩短对肽分离的影响
研究系统比较了10 μm粒径色谱柱与更小粒径（3.5和5 μm）色谱柱的性能。尽管小粒径分析柱通常提供更高的分辨能力，但10 μm的ResiPure Advanced C18柱在杂质组1–7中显示出惊人的可比分离效果，为合成肽的质量和纯度评估提供了足够的分辨率。在所有色谱柱中，Sunfire C18（3.5 μm）表现出最高的整体性能（平均Rs=2.05），Discovery C18（5 μm）次之（平均Rs=1.69），ResiPure Advanced C18则显示出可比的选择性（平均Rs=1.32）。对于所有色谱柱，将梯度陡度增加到5%或10% ACN/min会显著降低分离质量和效率，导致纯度测定不令人满意。这表明足够平缓的梯度对于合成肽的可靠纯度控制至关重要。尽管梯度陡度是分离的关键因素，但在保证再平衡时间恒定的前提下，色谱方法的截短对保留时间的影响可以忽略不计。因此，方法缩短在未损害分离效率的情况下减少了分析时间和溶剂消耗，比增加梯度陡度是更实用的缩短分析时间的方法。
3.2 流速、柱温和改性剂对分离性能的影响
对于ResiPure Advanced C18柱，将流速从1.0 mL/min增加到1.5 mL/min改善了峰形和分辨率，尽管理论塔板数并未增加。平均Rs从1.31增至1.63。流速增至2.0 mL/min（背压97 bar）进一步改善了分离（平均Rs=1.73）。对于Discovery C18，也观察到了类似的改善（平均Rs在1.0、1.5和2.0 mL/min下分别为1.69、1.86和2.05）。将柱温升高至40°C或50°C显示出与增加流速相当的选择性和分辨率改善效果，但这种效应强烈依赖于固定相化学性质。对于ResiPure Advanced C18，平均Rs从1.31（30°C）增至1.60（40°C）和1.67（50°C）。Sunfire C18表现出可比行为，平均Rs从2.05改善至2.35和2.47。而Discovery C18则显示出最小的温度依赖性，Rs在测试范围内基本保持恒定（Rs=1.69–1.71）。在流动相改性剂方面，用甲酸（FA）替代TFA产生了依赖于色谱柱的变化。对于ResiPure Advanced C18，平均Rs从1.31（TFA）增加到1.84（FA），并实现了杂质组7的完全分离。Discovery C18在更换改性剂后分离也有所改善（平均Rs从1.69增至2.42）。相反，Sunfire C18表现出强烈的极性依赖行为：乙酰化肽在FA下分辨率更好，而所有非乙酰化组（1、2、4和5）则与进样峰共洗脱。值得注意的是，FA使得所有三根色谱柱都能完全分离血管紧张素衍生肽组（组7），这在TFA条件下是无法实现的。
3.3 提升从HPLC到FPLC的可转移性
为了评估分析HPLC数据向制备FPLC条件转移的可行性，研究使用筛选柱的ACN洗脱值作为直接预测因子，对P8–P10和P17–P19进行了重新合成和纯化。预测值与实际洗脱值之间的偏差范围为-15.3%至-18.1%（平均-17.1%），这实际上阻碍了第一次运行中有意义的纯化，并存在目标化合物与进样峰共洗脱的风险。通过应用开发的校正公式，显著提高了准确性，将平均偏差降低了11.8%，达到平均-5.23%。由于ResiPure Advanced C18耐受更高的流速，研究评估了更高流速下的洗脱值是否与制备系统更具可比性。使用1.5 mL/min的保留数据将平均偏差降至-3.75%，2.0 mL/min则进一步将平均偏差改善至-3.00%。这些数值表明，尽可能匹配分析和制备模式之间的流速可以提高转移准确性。应用优化的工作流程重新纯化杂质组1–4和6，所有肽的纯度均>80%，平均纯度为92.9%，平均分离收率为32.0%。乙酰化肽组（3和6）显示出比非乙酰化组（收率25.3%，纯度91.1%）更高的收率（41.4%）和纯度（95.5%），这与它们在TFA条件下更高的分析分辨率一致。这些观察结果支持了分析HPLC分辨率是制备可纯化性的可靠预测指标。
4 结论与展望
本研究系统性地探讨了影响肽分离的关键色谱参数及其对从分析HPLC到制备FPLC方法转移的意义。尽管ResiPure Advanced C18色谱柱具有较大的粒径（10 μm），但其性能与更小粒径的色谱柱相当，支持了其适用于快速方法筛选、合成肽纯度测定和放大生产。将流速从1.0 mL/min增加到1.5 mL/min提高了效率和分辨率，而进一步增加到2.0 mL/min仅带来微小的改善。提高柱温对分离效率的改善效果与增加流速相当，但这种效果强烈依赖于固定相化学性质。用FA替代TFA引起了显著且依赖于色谱柱的选择性和分辨率变化，使得先前未分离的物种得以分离，突显了实现更绿色工作流程的潜力。所开发的校正方程显著提高了HPLC-to-FPLC转移的准确性，将洗脱百分比的偏差从约17%减少到不足5%。这一改进使得无需迭代重新优化即可对紧密相关的肽混合物进行初始制备纯化，实现了平均纯度超过90%的目标，证实了直接分析到FPLC转移的实际可行性。所提出的方法最大限度地减少了溶剂和材料的消耗，同时为在肽生产和分析质量控制中开发绿色、可转移的工作流程提供了可适应性的基础。
