对BORIS、Ethovision、DeepLabCut和SimBA四种方法在丙戊酸小鼠模型中量化自闭症谱系障碍样行为的比较分析

自闭症小鼠模型中，DLC/SimBA机器学习方法在社交和重复行为检测上优于传统Ethovision和BORIS手动评分，结果显示自动化分析更精准且一致性更高。

Zineb Bouargane|Francisco E. Olucha-Bordonau|Mohammed Bennis|Saadia Ba-M’hamed|Fatima-Zahra Lamghari-Moubarrad

卡迪阿亚德大学（Cadi Ayyad University），自然科学学院，药理学、神经生物学、人类生物学与环境实验室，Prince My Abdellah路2390号，40000马拉喀什，摩洛哥

摘要

临床前研究通常依赖动物观察和随后的行为分析来研究大脑功能；然而，传统方法被认为耗时且容易出错。相比之下，新兴的机器学习（ML）方法现在能够实现快速、客观和高分辨率的行为评估，例如DeepLabCut（DLC），结合后处理工具如Simple Behavioral Analysis（SimBA），可以实现高分辨率的行为分类。DLC提供准确的无标记跟踪，而SimBA则提高了行为识别的敏感性和可靠性。本研究测试了这样一个假设：与传统的半自动化跟踪（Ethovision）和手动评分（BORIS）相比，基于姿态估计的行为分析在检测丙戊酸（VPA）诱导的ASD小鼠模型中的社会行为和运动模式组织功能障碍方面具有更高的敏感性。我们的结果显示，在所有方法中，VPA暴露的小鼠都表现出显著且一致的核心ASD样症状。在3室测试中，跟踪小鼠的鼻子比Ethovision分析方法更能精确地检测出VPA暴露小鼠的社交缺陷。相关性和Bland-Altman分析表明，两种方法在笼子附近停留时间方面有中等程度的一致性，但在笼子接近时间方面的一致性较低。此外，VPA暴露的小鼠在两种评分方法下都表现出更多的重复性行为（自我梳理和直立）。实际上，DLC和BORIS的评分结果在Bland-Altman分析中显示出更高的相关系数和更低的偏差。总体而言，这项研究表明，整合DLC和SimBA可以提高行为评分的准确性，克服传统方法的局限性，并在检测小鼠的ASD样表型方面超越了商业自动化跟踪系统。

引言

分析啮齿动物的行为对于评估临床前研究中的大脑正常功能至关重要，可以通过各种行为测试来进行评估[1]、[2]。传统上，啮齿动物的行为由受过训练的观察者通过实时观察或在观看视频录像后进行回顾性分析来评估。这些观察者使用铅笔、纸和秒表，或使用免费软件（如BORIS[3]、BehaView[http://www.pmbogusz.net/?a=behaview）和JWatcher[https://www.jwatcher.ucla.edu/）来评分BORIS是一种开源软件工具，专为手动行为评分设计，被认为是准确性的黄金标准[4]。观察者逐帧记录行为，从而可以进行细致的分析。他们可以获取每次观察的详细时间信息，包括频率、持续时间、首次事件发生的延迟以及事件之间的间隔[3]。然而，尽管这种方法准确，但它可能劳动密集且耗时。根据所需行为数量的不同，通常需要视频长度的数倍时间来进行注释。此外，这种方法可能受到观察者疲劳和偏见的影响，尤其是在较长的录像中。

在跟踪特定兴趣区域（ROIs）内动物的运动、位置和活动时，有多种商业产品可用于视频的半自动化行为分析，例如Ethovision®（Noldus，荷兰瓦赫宁根）和Any-Maze®（Stoelting，美国伊利诺伊州伍德代尔）。Ethovision因其用户友好的界面而被广泛用于行为分析。它通过识别动物与背景之间的颜色差异来估计动物身体的整体位置[5]。虽然这种系统具有创新性且被广泛采用，但它无法跟踪特定的身体部位，如鼻子，而这对于某些行为研究可能是必不可少的。此外，这类跟踪程序价格昂贵，并且在检测精细运动行为（如梳理、嗅探、跳跃和直立）时经常遇到困难。

解决这些挑战的一个潜在方法是视频录像的自动化分析。人工智能（AI）和机器学习（ML）的进步显著提高了跟踪动物多个身体部位和准确分类行为的能力。DeepLabCut（DLC）是一种越来越多地被用于动物行为研究的开源软件，它提供了一种基于深度学习的运动跟踪和无标记姿态估计方法[6]、[7]。该软件训练深度神经网络根据用户提供的从视频中提取的标注帧来预测姿势，随后生成跟踪数据（CSV/H5文件），捕捉各种身体部位的位置、方向和运动[8]。为了进一步细化行为分析，需要后处理工具将表示身体部位空间和时间坐标的数值数据分类为社交行为。在这方面，Simple Behavioral Analysis（SimBA）作为一个开源Python工具包，为行为分类提供了显著的改进[9]。SimBA提供了一个易于使用的界面，不需要编程知识，从而扩大了其研究人员的可访问性。DLC和SimBA都受益于活跃的社区支持和持续的功能开发，增强了它们的能力。然而，将它们整合到行为研究中需要大量的计算资源，并针对特定的实验设置进行优化。

由于ASD的特点是社交调查受损和重复性受限行为（RRBs）[10]，准确量化这些行为不仅具有方法论意义，而且直接影响机制解释。特别是，社交能力的缺陷与感觉处理和电路层面的功能障碍密切相关，而RRBs则与运动模式调节和行为灵活性受损有关。因此，提高测量这些行为的分辨率可以超越简单的表型描述，实现更深入的机制推断。因此，我们测试了使用DLC结合SimBA中的ML分类器进行基于姿态的跟踪是否比传统的身体中心跟踪或手动评分在检测VPA模型的核心功能障碍方面具有更高的敏感性。最近的研究已经证明了DLC和SimBA在基于ML的啮齿动物行为分析中的有效性[11]、[12]。在本研究中，我们将这种方法扩展到产前VPA诱导的ASD模型，并直接将其与手动和商业方法进行比较，以评估敏感性和一致性。

章节片段

动物

雄性和雌性瑞士小鼠（Janvier实验室，法国）在受控条件下饲养（22±1°C，50±5%湿度，12小时光照/黑暗周期，食物和水自由供应）。雌性小鼠在夜间交配（2:1），阴道塞的存在被标记为E0.5。妊娠通过第一周内体重增加（>3克）来确认。所有程序均符合欧盟指令2010/63/EU，并获得了Jaume I大学生物伦理委员会的批准（2024-VSC-PEA-0105）。

研究设计

在E12.5时，怀孕

Ethovision分析

在社交行为测试期间，Ethovision显示VPA暴露的小鼠与SAL小鼠相比，在社交笼子中的停留时间减少（图2A，补充表S1）。基于与社交笼子接近程度的分析表明，雄性VPA动物的社交能力受损，它们与刺激小鼠互动的时间少于对照组，而雌性小鼠没有差异（图2B，补充表S1）。

关于社交新颖性

讨论

本研究旨在比较不同方法在VPA诱导的ASD小鼠模型中评分行为的可靠性，并评估方法学分辨率如何影响相关行为障碍的检测。结果表明，手动评分（BORIS）与基于深度学习的分析（DLC/SimBA）之间存在显著差异和相关性，半自动化跟踪（Ethovision）与DLC/SimBA之间也存在差异。我们的发现表明，VPA暴露的小鼠表现出受损的

CRediT作者贡献声明

Zineb Bouargane：撰写——原始草稿、方法学、调查、正式分析、概念化。Francisco E. Olucha-Bordonau：撰写——审阅与编辑、验证。Mohammed Bennis：撰写——审阅与编辑、验证。Saadia Ba-M’hamed：撰写——审阅与编辑、验证、监督、方法学、正式分析、概念化。Fatima-Zahra Lamghari-Moubarrad：撰写——审阅与编辑、验证、监督、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。