摘要
铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，以脂质过氧化和铁代谢紊乱为特征，与肝脏及神经退行性疾病密切相关。7-酮基胆固醇（7KC）作为一种胆固醇氧化产物，高浓度时已知会诱导氧化应激和炎症。然而，低于毒性阈值浓度的7KC的作用尚不明确。本研究旨在探讨低浓度7KC在肝细胞和神经元细胞铁死亡过程中可能存在的毒物兴奋效应。
引言
胆固醇稳态和代谢主要由肝脏调控。为避免细胞内胆固醇水平升高造成的损伤，肝细胞会将多余的胆固醇氧化为氧化固醇。位于第7位碳原子被氧化的氧化固醇（如7KC）可通过细胞色素P450家族酶或活性氧（ROS）生成，并存在于高胆固醇食物中。高浓度7KC具有毒性，能促进ROS生成、炎症和细胞膜破坏，与动脉粥样硬化、肝病及神经退行性疾病等多种病理状态相关。有趣的是，其安全数据表中却缺乏急慢性毒性数据，且其潜在的生理功能或有益效应知之甚少。铁死亡自2012年被定义以来，因其在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）中的关键作用而备受关注。胆固醇及其前体7-脱氢胆固醇（7DHC）与铁死亡之间存在潜在联系。本研究假设，低于毒性水平的7KC可能具有有益的毒物兴奋效应，从而改善致死性促铁死亡条件下的细胞毒性。
材料与方法
本研究使用小鼠高分化肝细胞系AML-12和小鼠海马神经元HT4细胞。通过20 µM Erastin（一种系统Xc−抑制剂）诱导AML-12细胞铁死亡，并使用不同浓度的7KC进行共处理。通过10 mM谷氨酸处理HT4神经元细胞诱导铁死亡。采用碘化丙啶（PI）排除法评估细胞活力。使用绿色CMFDA染料和流式细胞术分析细胞硫醇水平。通过硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定和高效液相色谱-荧光（HPLC-荧光）分析测量脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）水平。利用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）分析脂肪酸甲酯（FAMEs）以确定细胞脂肪酸组成。使用尼罗红染色和流式细胞术评估细胞内脂质水平。通过实时荧光定量PCR（qPCR）和RNA测序（RNA-seq）分析基因表达。使用针对CYP51的siRNA进行基因敲低，并通过蛋白质印迹法（Western blot）验证蛋白水平。数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey-Kramer HSD事后检验进行统计分析，显著性水平设为p< 0.05。
结果
3.1. 7KC预防铁死亡性细胞死亡
低浓度（≤20 µM）的7KC对AML12肝细胞活力无影响，而浓度高于30 µM时则显著降低细胞活力。当使用Erastin诱导铁死亡时，添加20 µM 7KC能显著保护细胞免于死亡（）。相比之下，使用另一种铁死亡诱导剂RSL3（GPX4抑制剂）时，7KC的保护作用较小（）。7KC对Erastin诱导的细胞死亡表现出剂量依赖性保护，在10 µM和20 µM时保护效果最佳，而更高毒性浓度（50 µM和100 µM）则与Erastin产生叠加的细胞死亡效应（）。相比之下，20 µM胆固醇未能减轻Erastin诱导的细胞死亡（）。在HT4神经元模型中，低毒性浓度的7KC（10 µM和20 µM）也能显著减轻谷氨酸诱导的铁死亡。
3.2. 7KC在铁死亡期间恢复细胞硫醇水平并降低脂质过氧化
Erastin处理12小时显著降低了细胞硫醇水平，而联合20 µM 7KC处理则使硫醇水平提高了1.3倍（）。Erastin处理增加了MDA（脂质过氧化标志物）水平，而添加7KC则阻止了MDA的积累（）。脂肪酸谱分析显示，Erastin处理显著降低了多种多不饱和脂肪酸（PUFA）如花生四烯酸（C20:4）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的水平，而Erastin与7KC联合处理对这些PUFA水平的影响较小或没有影响（）。
3.3. 7KC差异性地影响铁死亡期间肝细胞中NRF2相关基因表达
在铁死亡条件下，与单独使用Erastin相比，7KC处理上调了谷胱甘肽合成限速酶——γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）的表达（）。而谷胱甘肽S-转移酶α1（GSTA1）和血红素加氧酶1（HO1）的表达在Erastin单独处理及与7KC联合处理时均被同等程度诱导（，）。使用NRF2特异性抑制剂ML385后，无论NRF2是否被抑制，细胞活力相似，这表明NRF2可能不介导7KC的有益效应（）。
3.4. 7KC降低铁死亡期间肝细胞内的中性脂质和胆固醇代谢
尼罗红染色显示，Erastin处理18小时显著促进了脂肪变性（细胞内中性脂质积累），而添加7KC则减少了这种积累（）。虽然7KC已知可抑制HMG-CoA还原酶，但使用他汀类药物（胆固醇合成抑制剂）与Erastin联用反而进一步降低了细胞活力，这表明抑制胆固醇合成本身并不能保护肝细胞免于铁死亡（）。RNA-seq分析的主成分分析（PCA）显示，对照组与7KC处理组聚类相似，而Erastin组与Erastin+7KC组聚类相近（）。然而，在Erastin+7KC组与Erastin组之间仍发现了22个差异表达基因。Erastin+7KC组合显著下调了胆固醇合成基因，如Hmgcs1和Hmgcr；而Erastin单独处理则上调了这些基因（）。在胆固醇合成的终末阶段，Erastin上调了固醇C5-去饱和酶（SC5D）的表达，而7KC处理则降低了SC5D的表达（）。负责将7DHC转化为胆固醇的7DHC还原酶（7DHCR）表达，在7KC处理（无论是否联合Erastin）后均降低（）。
3.5. 抑制CYP51不能防止铁死亡
羊毛甾醇14α-去甲基酶（CYP51A1）是胆固醇生物合成中的关键酶之一。Erastin处理24小时（而非6小时）上调了CYP51蛋白水平，而添加7KC则缓和了这种诱导（，）。然而，使用siRNA敲低CYP51并未保护细胞免受铁死亡，Erastin单独处理与CYP51 siRNA联合Erastin处理的效果无显著差异（）。
3.6. 在肝细胞铁死亡过程中，7KC表现出比7DHC更好的保护作用
7DHC是胆固醇生物合成途径中的中间代谢物，有研究显示其能抵抗铁死亡。7DHC可通过CYP7A1代谢为7KC。使用鹅去氧胆酸（CdCA）抑制CYP7A1表达以阻止7DHC向7KC转化（）。结果显示，7KC改善了Erastin诱导的细胞死亡，而7DHC在相同条件下未能提高细胞存活率。更重要的是，在抑制7DHC氧化的同时添加7DHC并未影响细胞活力。有趣的是，7KC与CdCA联用比单独使用7KC在铁死亡条件下提供了更好的细胞保护（）。
讨论
本研究首次证明了低于毒性水平的7KC对铁死亡的影响。研究发现，低浓度（如20 µM）的7KC（而非胆固醇）能保护细胞免受Erastin或谷氨酸诱导的铁死亡，而高浓度则具有细胞毒性，并在与Erastin联用时产生叠加的杀伤效应，符合毒物兴奋效应概念。7KC的有益效应与改善细胞内硫醇水平、限制应激诱导的肝脏脂肪变性和抑制胆固醇合成相关。值得注意的是，7KC本身不具有抗氧化特性或螯合能力，却能通过刺激GCLC表达、促进硫醇生成来对抗铁死亡。铁死亡诱导剂Erastin导致了细胞内脂质积累和胆固醇合成基因表达上调，而7KC显著降低了这些效应。然而，这种脂质抑制效应似乎并非7KC发挥保护作用的主要机制，因为使用他汀类药物或siRNA抑制胆固醇合成途径（如CYP51）并未提供保护，反而使细胞对死亡更敏感。与先前研究提示的7DHC的保护作用不同，本研究表明其代谢产物7KC在促铁死亡环境下具有更优越的保护效果，但这种保护作用需要精确控制浓度。7KC的保护作用与细胞硫醇水平正常化和脂质过氧化降低（表现为MDA水平下降）相关。脂肪酸谱分析表明，7KC可能通过减少特定多不饱和脂肪酸（如花生四烯酸、EPA、DHA）的过氧化来发挥作用。尽管高单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸比例被认为有益于抵抗铁死亡，但本研究未发现7KC通过此途径起效的关键证据。总之，7KC通过上调GCLC（可能不依赖NRF2）、恢复硫醇稳态、减少脂质过氧化和积累，在低浓度时发挥对抗铁死亡的保护作用（）。
未来展望
鉴于7KC在低浓度下能剂量依赖性地预防铁死亡，它有可能被用作治疗剂。然而，即使在低浓度下，根据患者的年龄和合并症，7KC也可能积累或降解。因此，未来研究有兴趣鉴定以7KC为骨架（7KC衍生物和代谢物）且具有更佳治疗窗口的分子，这些分子在低浓度下可能与7KC一样有效或更有效，同时在较高浓度下毒性更低。
