王刚|梁莫|王超|张宇婷|李雅宁|袁金波|金海明|陈鹏|陈迪|周建鹏|何伟|徐家科
摘要
背景
糖皮质激素诱导的股骨头坏死（GIONFH）的发病机制尚不清楚，且缺乏有效的治疗方法。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）调节破骨细胞的生成，但其在GIONFH中的作用及其转化价值仍不清楚。罗布瑞酸（RA）是一种来自Gentiana macrophylla Pall.的三萜类化合物，具有抗炎活性，然而它是否通过靶向PTP1B来抑制破骨细胞过度活跃从而预防GIONFH仍不清楚。
方法
在临床实验中，对GIONFH患者的股骨头进行了H&E染色、CTSK免疫组化（IHC）和CTSK/PTP1B共免疫荧光分析，以研究PTP1B的表达及其与破骨细胞的共定位。在动物实验中，用地塞米松（DEX）和RANKL诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）以模拟GIONFH相关的破骨细胞过度活跃，然后给予RA。通过分子对接、表面等离子体共振（SPR）和细胞热位移测定（CETSA）进行靶点验证。在动物实验中，使用甲基泼尼松龙（MPS）诱导的GIONFH大鼠模型来研究RA对PTP1B表达和破骨细胞活性的影响。
结果
在GIONFH患者的股骨头样本中，IHC分析显示坏死区域PTP1B的表达显著上调，而共免疫荧光染色证实PTP1B与破骨细胞特异性标记物CTSK共定位，两种蛋白质的水平同步升高。体外实验中，RA以剂量依赖的方式抑制了DEX和RANKL共同刺激诱导的破骨细胞形成。靶点预测和多维度验证（分子对接、SPR、CETSA）确定PTP1B是RA的直接结合靶点，其高结合亲和力（KD=13 μM）通过SPR得到验证。RA抑制了DEX处理的破骨细胞前体及暴露于DEX的成熟破骨细胞中的PTP1B表达。在大鼠GIONFH模型中，Micro-CT检测显示RA以剂量依赖的方式减轻了GIONFH相关的骨侵蚀，增加了BV/TV和Tb.N，降低了Tb.Sp。H&E染色表明RA减少了坏死腔的形成并减轻了骨丢失，而TRAP染色和CTSK IHC染色显示RA降低了GIONFH中的破骨细胞活性。Western blot检测显示RA干预后PTP1B、RANK、NFATc1、MMP9和CTSK的表达减少。IHC分析RhoA、NF-κB和NFATc1在GIONFH中的表达表明RA抑制了这些关键蛋白在PTP1B下游的表达。
结论
RA通过靶向PTP1B抑制破骨细胞过度激活来预防GIONFH，同时抑制了RhoA/NF-κB/NFATc1通路。RA是进一步研究GIONFH的潜在临床前候选药物。
部分摘录
引言
糖皮质激素是一类具有强大抗炎作用的药物，据估计，过去20年全球有2-3%的人口接受过局部或全身性的糖皮质激素治疗（Pofi等人，2023年）。然而，超生理剂量的糖皮质激素使用可能导致一系列并发症，包括骨质疏松症和代谢紊乱，而GIONFH在年轻人中较为常见（Chang等人，2020a年）。鉴于糖皮质激素的广泛使用
材料
Herbpurify（中国成都）提供了RA（纯度>98%）。Apexbio（美国休斯顿）提供了MPS（纯度>99%）。PTP1B兔抗体（11334-1-AP）和MMP9兔抗体（10375-2-AP）购自Proteintech（中国武汉）。Santa Cruz（美国圣何塞）提供了RANK小鼠mAb（sc-374360）、NFATc1小鼠mAb（sc-7294）、CTSK小鼠mAb（sc-48353）和β-actin小鼠mAb（sc-47778）。BD Pharmingen（美国圣地亚哥）提供了用于Western blot和免疫荧光的相应二抗。PTP1B在GIONFH坏死区域高表达，并与破骨细胞活化相关
为了研究PTP1B在GIONFH中的潜在作用，我们首先使用组织学和免疫学方法分析了临床样本。H&E染色显示坏死区域的空腔数量明显增加（图1A、1C），这是与异常骨代谢相关的GIONFH的典型病理特征。IHC分析进一步显示，PTP1B阳性细胞在坏死区域明显聚集
讨论
GIONFH仍然是一种复杂的疾病，尤其是由于其发病机制难以明确，因此有效的治疗策略非常具有挑战性（Qi和Zeng，2015年）。作为GIONFH的最终治疗方法，全髋关节置换术（THA）具有较高的感染和翻修风险（Bergh等人，2014年；Sax等人，2021年；Salman等人，2023年），这推动了寻找髋关节保护疗法的研究，特别是针对年轻人和中年患者（Wu等人，2023年）。在中国，草药已被广泛用于临床治疗数十年
结论
总之，这项探索性的临床前研究表明，RA通过靶向PTP1B抑制破骨细胞过度激活来减轻GIONFH相关的股骨头骨丢失，为RA作为进一步临床前研究的候选药物提供了初步支持。鉴于本研究仅关注破骨细胞（未评估成骨细胞或血管生成过程），未来的研究将优先考虑药代动力学分析、长期疗效和安全性评估以及直接比较
数据可用性声明
本文的所有支持数据均包含在本文/补充材料中，如有进一步疑问，请联系相应的作者。
作者贡献
GW和LM负责撰写和修改手稿；GW、LM和YZ进行了动物实验；CW和YL进行了细胞实验和Western blot；JY和HJ进行了micro-CT扫描和组织化学分析；DC指导了手稿的修改，WH和JX共同确定了最终版本。
伦理声明
该研究获得了广州中医药大学动物伦理委员会（编号20190722001）和深圳先进技术研究院动物伦理委员会（编号SIAT-IACUC-20240429-YYS-JSYWZX-XJK-A2658）的批准。临床研究获得了广州中医药大学第一附属医院伦理委员会的批准（编号K-2022-059）。所有患者均签署了书面知情同意书参与本研究。
资助
本研究得到了深圳医学研究基金（B2302005）、国家自然科学基金（82350710800）、国家重点研发计划（2024YFA0919200）、深圳市科技计划（KCXFZ20240903094059020）和深圳市科技研究资助（JCYJ20250604183151067）的支持。作者贡献声明
我们声明，本文中列出的作者‘罗布瑞酸通过限制过度活跃的破骨细胞活性来保护糖皮质激素诱导的股骨头坏死’均做出了各自的贡献。
王刚：撰写 - 原始草稿，撰写 - 审稿与编辑
王超：研究，方法学（细胞实验，Western blot）
梁莫：研究，资源（动物实验）
张宇婷：研究，资源（动物实验）
作者贡献声明
王刚：撰写 – 原始草稿。梁莫：方法学。王超：方法学。张宇婷：方法学。李雅宁：方法学。袁金波：软件，方法学。金海明：软件，方法学，概念化。陈鹏：软件，资源，方法学。陈迪：监督，资源。周建鹏：监督。何伟：撰写 – 审稿与编辑。徐家科：撰写 – 审稿与编辑。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢西澳大利亚大学显微镜、表征与分析中心的National Imaging Facility（NCRIS）设施以及科学和技术支持。
