土壤，作为植物生长的基石，却日益面临盐渍化的严峻挑战。全球范围内，大面积的耕地因盐分累积而生产力下降，这不仅威胁粮食安全，也对具有重要经济价值的药用植物栽培构成了严重制约。何首乌，作为一种传统中药材，其干燥块根具有抗炎、抗氧化等多种药理活性，市场需求巨大。然而，该植物深受连作障碍困扰，加之土地资源日益紧张与土壤盐渍化不断加剧，严重限制了其标准化种植与产量提升。因此，探究盐胁迫下何首乌的生长响应与调控机制，对于拓展其适宜种植范围、增强其对逆境的适应能力，乃至推动药用植物产业的可持续发展，都具有深远意义。为此，一篇发表在《Scientia Horticulturae》上的研究，为我们深入理解何首乌如何应对盐胁迫打开了一扇窗。
为了系统解析这一问题，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，对何首乌组培苗进行不同浓度NaCl（0, 50, 100, 150, 200 mmol·L-1）的胁迫处理，并分时间点采集根、茎、叶样本。其次，通过高效液相色谱（HPLC）测定根和茎中二苯乙烯苷（THSG）的含量。再者，利用生物信息学工具从何首乌全基因组中鉴定NAC转录因子家族成员，并进行保守结构域、基因结构、启动子顺式作用元件等分析。此外，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测盐胁迫下筛选出的部分FmNAC基因及THSG合成通路关键酶基因的表达模式。最后，结合AlphaFold3对FmNAC蛋白与关键酶基因启动子的潜在互作进行预测，并通过相关性网络分析整合生理指标、基因表达与代谢物积累数据。
研究结果
4.1. 盐胁迫下何首乌农艺性状和生物量的变化
盐浓度升高普遍抑制了何首乌的生长，所有测量的生物量参数呈总体下降趋势。根系生长受抑制尤为明显，处理第10天，根长和根鲜重最大降幅分别达76.62%和80.09%。茎和叶的生长也受到类似抑制，但低浓度（50 mmol·L-1）处理下茎长在部分时间点略有增加，属于例外情况。
4.2. 盐胁迫下何首乌叶绿素含量的变化
叶绿素含量随盐浓度和处理时间发生显著变化。在50 mmol·L-1（N1）处理下，叶绿素含量逐渐增加；在100和150 mmol·L-1（N2, N3）处理下呈先升后降趋势；而在200 mmol·L-1（N4）处理下则呈先降后升趋势。
4.3. 盐胁迫下何首乌渗透调节物质含量分析
可溶性糖和脯氨酸（Pro）含量总体呈上升趋势。可溶性糖含量在处理第1天和第5天均显著高于对照，第10天时在N1组达到最大值。脯氨酸含量随处理浓度升高和处理时间延长而逐渐增加，在处理第10天、N4浓度下达到最大值464.4033 ± 10.4999 µg·g-1，表明何首乌通过增加脯氨酸含量来缓解盐胁迫伤害。
4.4. 次生代谢物含量分析
根和茎中芪苷（主要指THSG）含量对不同盐浓度处理的响应存在器官特异性。在茎中，除N3和N4处理组随时间呈逐渐增加趋势外，其他处理组均呈现先降后升的趋势。在根中，除N4组外，所有处理组均呈现先升后降的趋势。
4.5. FmNAC基因家族成员及其理化性质分析
通过全基因组分析，从何首乌中共鉴定出83个FmNAC基因。理化性质预测显示，这些基因编码的氨基酸数量在197到650之间，分子量在22,645.22 到 73,366.64 Da之间，大部分为酸性亲水蛋白。
4.6. FmNAC转录因子保守基序和基因结构分析
所有83个FmNAC蛋白均含有NAM结构域。共预测到10个保守基序（Motif1-10），它们构成了NAC蛋白的A到E五个亚结构域。ONAC003亚家族的成员在基序组成上与其他亚家族存在显著差异。
4.7. FmNAC转录因子顺式作用元件预测和基因结构分析
启动子预测发现，FmNAC基因的启动子区含有大量与光响应、茉莉酸甲酯（MeJA）响应、脱落酸（ABA）响应及低温响应等相关的顺式作用元件，表明其可能参与非生物胁迫和激素应答。基因结构分析显示UTR（非翻译区）分布不均。
4.8. 何首乌FmNAC基因的染色体定位及种内/种间共线性分析
83个FmNAC基因不均匀分布在何首乌的11条染色体上，密度最低在Chr1（2个基因），最高在Chr5（14个基因）。种内共线性分析鉴定出33个基因对，均由全基因组复制（WGD）和片段复制事件导致，其Ka/Ks比值均小于1，表明在进化中经历了强烈的纯化选择。与拟南芥的种间共线性分析揭示了63个同源基因对。
4.9. 何首乌THSG生物合成通路关键酶基因及胁迫响应FmNAC基因表达模式分析
qRT-PCR结果表明，筛选出的13个含有丰富胁迫响应元件的FmNAC基因在不同盐浓度处理下，于根、茎、叶中的表达水平存在显著差异，且具有组织特异性。例如，FmNAC14在多个组织和处理中表达上调，而FmNAC51和FmNAC70则在多数情况下表达下调。
4.10. 何首乌THSG生物合成通路关键酶基因表达模式分析
THSG合成通路中的关键酶基因，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合成酶（CHS）及细胞色素P450酶（CYP450）相关基因的表达，在不同盐胁迫程度和组织中均发生显著改变，这影响了相关酶的活性，进而调控THSG的合成。
4.11. 何首乌FmNAC基因、THSG合成通路关键酶基因与生理生化指标间调控网络分析
相关性网络分析揭示了FmNAC基因表达与何首乌生长生理指标及THSG含量之间的复杂关系。例如，根长和根鲜重与FmNAC2、FmNAC34、FmNAC67的表达呈极显著正相关，而与FmNAC14、FmNAC52、FmNAC53等的表达呈显著负相关。THSG含量与FmNAC51、FmNAC70的表达呈极显著负相关。AlphaFold3预测表明，FmNAC蛋白可能与THSG合成关键酶基因的启动子区发生互作，IPTM和PTM评分支持了这一预测。
研究结论与讨论
本研究系统阐明了盐胁迫对何首乌多层面的影响。结论表明，盐胁迫显著抑制了何首乌的生长指标（如叶面积、株高、根长），但诱导了渗透调节物质（脯氨酸）的积累以及器官特异性的芪苷（THSG）合成响应。在分子层面，研究首次在全基因组水平鉴定出何首乌的83个FmNAC基因，并揭示其表达具有组织和胁迫特异性。关键发现包括FmNAC51和FmNAC70与THSG含量呈负相关，而FmNAC14与脯氨酸含量正相关但与多种生长指标负相关。相关性分析与AlphaFold3互作预测共同提示，FmNAC转录因子可能通过调控THSG生物合成通路中的关键酶基因，从而介导盐胁迫下的生理与代谢响应。
这项研究的意义在于，它首次将何首乌在盐胁迫下的形态生理变化与NAC转录因子家族的分子调控网络联系起来，构建了一个从胁迫信号感知到次生代谢产物合成的初步调控框架。这不仅为何首乌耐盐核心候选基因的筛选和功能验证提供了直接靶点和重要理论依据，也为利用分子手段改良药用植物耐盐性、探索在盐渍化土地上栽培何首乌的可行性提供了新思路。未来研究可专注于对FmNAC51、FmNAC70等关键基因进行功能验证，以精确解析其在盐胁迫响应及THSG合成中的调控作用，从而将理论发现转化为实际应用潜力。
