引言
胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的实体恶性肿瘤之一，五年生存率低于10%，其预后不良主要归因于晚期诊断和复杂的肿瘤微环境（TME）。代谢重编程，尤其是乳酸代谢，在肿瘤进展中扮演着核心角色，通过瓦博格效应（Warburg Effect）产生大量乳酸，进而酸化微环境、抑制免疫功能并促进肿瘤生长。本研究旨在利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学和机器学习方法，深入探究PDAC中乳酸代谢的异质性、细胞间通讯及其临床意义。
材料与方法
研究整合了来自国际癌症基因组联盟（ICGC）和基因表达综合数据库（GEO）的多个PDAC转录组数据集及临床信息。单细胞数据分析使用Seurat软件包进行质控、归一化和聚类，并通过Harmony方法校正批次效应。使用AUCell算法评估每个细胞中320个乳酸代谢相关基因的活性，并通过InferCNV分析基于拷贝数变异（CNV）识别恶性细胞。空间转录组数据（10X Genomics Visium平台）通过SPATA2和CellTrek等软件包进行处理、反卷积分析和细胞空间定位推断。细胞通讯分析采用CellChat算法，转录因子（TF）调控网络通过SCENIC分析构建。预后模型的建立综合运用了包括随机生存森林（RSF）、弹性网络（Enet）和StepCox在内的10种机器学习算法进行集成学习，并在多个独立队列中进行验证。此外，还进行了基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析、基因集富集分析（GSEA）、药物敏感性分析以及免疫检查点和肿瘤免疫功能障碍与排斥（TIDE）分析。研究最后通过体外细胞实验（包括RT-PCR、Western blot）和临床组织样本的免疫组化（IHC）对关键发现进行了验证。
结果
1. 单细胞维度还原、聚类与注释
分析GSE205354单细胞数据集，在经过质控后保留了50,795个细胞，聚类为26个簇，并注释为T细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、星状细胞、中性粒细胞、自然杀伤（NK）细胞、肥大细胞、导管细胞1、导管细胞2、施万细胞和腺泡细胞共13种主要细胞类型。导管细胞2被鉴定为潜在的恶性细胞群。
2. 基于InferCNV识别恶性及乳酸代谢活跃的恶性细胞
以巨噬细胞、内皮细胞和星状细胞为参照，InferCNV分析确认导管细胞2为具有高CNV水平的恶性细胞。进一步通过AUCell评分，从恶性细胞中鉴定出521个乳酸代谢高度活跃的细胞，其AUCell评分显著高于非活跃细胞（p < 0.001）。差异表达基因（DEG）分析显示，这些活跃细胞在类固醇激素反应、细胞因子产生正调控、三磷酸腺苷（ATP）代谢过程等生物过程以及朊病毒疾病、氧化磷酸化和胰腺分泌等KEGG通路中显著富集。
3. 一致性聚类鉴定乳酸代谢亚型
基于320个乳酸代谢相关基因的表达谱进行无监督一致性聚类，将PDAC患者分为两个稳定亚型（Cluster 1和Cluster 2）。生存分析显示，Cluster 2患者的生存率显著优于Cluster 1患者（p = 0.0085）。两个亚型间的差异表达分析发现了69个DEGs，其中Cluster 1中上调的基因主要与核糖体RNA相关，而下调的基因则富集于吞噬作用、补体激活（经典途径）和体液免疫反应等免疫相关通路。
4. 乳酸代谢相关基因预后模型的构建与验证
通过整合转录组层面（PDAC vs. 对照）、单细胞层面（恶性导管细胞2 vs. 其他细胞）以及乳酸代谢活跃恶性细胞 vs. 其他细胞的差异基因，筛选出7个关键重叠基因。应用集成机器学习算法，最终筛选出由溶菌酶（LYZ）和多聚免疫球蛋白受体（PIGR）两个基因构成的预后模型（StepCox [backward] + Enet [α = 0.5]）。该模型在训练集（ICGC， n=92）和三个独立验证集（GSE28735, GSE62452, GSE183795）中均能有效将患者分为高风险和低风险组，高风险与更短的总生存期显著相关。风险评分在两个乳酸代谢亚型间也存在显著差异。
5. 预后相关基因作为乳酸代谢生物标志物的筛选
LYZ和PIGR的表达在乳酸代谢亚型间存在显著差异。相关性分析表明，LYZ与B细胞、乳酸代谢活跃的恶性导管细胞及巨噬细胞呈正相关；PIGR则与恶性导管细胞和成纤维细胞正相关。生存分析显示，LYZ和PIGR的高表达与更好的生存预后相关。GSEA提示，LYZ相关基因富集于KRAS信号上调、IL2-STAT5信号等通路；PIGR相关基因则富集于上皮-间质转化（EMT）、KRAS信号上调和干扰素-γ反应通路。来自人类蛋白质图谱（HPA）的免疫组化图像证实了LYZ和PIGR蛋白在PDAC组织中的高表达。
6. PDAC中的空间转录组异质性分析
对空间转录组数据（GSM6177614）的分析识别出五个细胞簇，根据基因表达特征和H&E染色被注释为癌细胞（上皮来源）、正常细胞和混合细胞。通过CellTrek将单细胞图谱映射至空间位置，发现免疫细胞（如巨噬细胞、T细胞、B细胞）主要分布于混合区域。乳酸代谢评分高的细胞在空间上定位于恶性胆管细胞区域。空间表达图谱显示，LYZ和PIGR基因在肿瘤组织区域富集。
7. 细胞通讯分析
CellChat分析揭示了不同代谢状态细胞间的通讯网络。与乳酸代谢低的恶性细胞（Ductal 2-LL）相比，乳酸代谢高的恶性细胞（Ductal 2-LH）显示出增加的MIF、NRG和HGF信号通路，以及减少的BTLA、CD40和LIGHT通路。深入分析发现，NRG信号通路在Ductal 2-LH细胞中表达显著，这些细胞作为中枢介质，与施万细胞和Ductal 2-LL细胞密切通讯，暗示了代谢重编程与神经侵袭（PNI）之间存在联系，形成了一个代谢-神经-免疫三方相互作用网络。
8. PDAC中的转录因子分析
SCENIC分析鉴定出与不同乳酸代谢状态相关的关键转录因子模块。乳酸代谢高的恶性胆管细胞特异性富集FOXA2(+)、MNX1(+)、GATA4(+)、POU2F3(+)和SOX21(+)等转录因子；而乳酸代谢低的细胞则与TBX21(+)、HOXA10(+)等相关。
9. 药物敏感性分析
药物敏感性预测显示，低风险患者对达沙替尼（dasatinib）、BI-2536和司帕霉素（sepantronium bromide）更敏感；而高风险患者则对AZD8055、AZ6102和硼替佐米（bortezomib）更敏感。LYZ和PIGR的表达水平与对特定药物的敏感性呈显著相关。
10. 免疫检查点、免疫逃逸与生物标志物基因的关联
免疫检查点分析发现，BTLA、CD96、HHLA2、ILRB4和TIGIT在LYZ高表达组中显著上调；HHLA2和ILRB4在PIGR高表达组中上调。TIDE分析表明，高风险组具有更高的TIDE评分和免疫排斥评分，提示其发生免疫逃逸的可能性更大。
11. 预后基因的泛癌分析
PIGR mRNA在肉瘤、子宫内膜癌、肺腺癌（LUAD）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾透明细胞癌（KIRC）等多种癌症中相较于癌旁组织显著高表达。LYZ在乳腺癌（BRCA）、胆管癌、结肠癌（COAD）等癌症中高表达，但在LUAD和肺鳞癌（LUSC）中低表达。两者表达水平在多数癌种中与免疫细胞评分呈正相关。
12. 细胞与组织验证
使用五种细胞系（ASPC-1, MIA-PACA2, PANC-1, HPDE, SW1990）进行的RT-PCR和Western blot实验验证了LYZ和PIGR在PDAC细胞系中的表达模式，与生物信息学分析结果一致。对临床PDAC组织样本的免疫组化分析进一步证实，PIGR在癌组织中的表达显著高于相邻正常组织。
讨论
本研究通过多组学整合策略，深入刻画了PDAC中乳酸代谢的细胞异质性及其临床意义。研究发现乳酸代谢活跃的恶性细胞亚群与更差的预后相关，并鉴定出LYZ和PIGR这两个关键的预后生物标志物。空间转录组学首次揭示了乳酸代谢相关转录因子与免疫检查点分子的空间共定位。特别重要的是，研究发现了乳酸代谢高的恶性细胞通过NRG信号通路与施万细胞进行通讯，这为理解PDAC的神经侵袭提供了新的代谢-神经-免疫交互视角。FOXA2、GATA4等转录因子被确定为高乳酸代谢状态的调控枢纽。尽管存在公共数据集的潜在偏倚和验证队列规模有限等局限性，但本研究为开发针对乳酸代谢和NRG通路的新型联合疗法奠定了理论基础，有望改善PDAC的治疗策略和患者预后。
结论
综上所述，本研究通过整合生物信息学分析，鉴定出PIGR和LYZ这两个与PDAC乳酸代谢密切相关的基因。实验验证证实PIGR在PDAC组织中显著过表达，使其成为一个关键的乳酸代谢生物标志物。这些基因可能通过调控KRAS信号、EMT等通路影响PDAC进展。本研究结果为进一步开发靶向乳酸代谢的临床策略提供了依据，并为PDAC治疗指明了新的潜在方向。
