1 引言
青蟹（Scylla paramamosain）是一种经济价值很高的海产蟹类，以其鲜美的味道和丰富的蛋白质、氨基酸及钙等营养素而备受青睐。然而，其坚硬的外壳给消费者食用带来了显著不便。在蟹的整个生命周期中，其生长、发育、繁殖和附肢再生需要进行十余次蜕壳。蜕壳过程会丢弃旧的角质层或外壳，包括鳃、前肠、后肠外膜和肠道残留物。外骨骼尚未完全硬化的蟹被称为软壳蟹。软壳蟹完全可食用，且比硬壳蟹含有更多的钙和更少的脂肪，这使其成为青蟹产业中最具商业前景的产品之一。通常，软壳蟹的外骨骼硬化约需2天。然而，软壳蟹保持高商业价值的时间相对较短，平均仅为3小时。在这种情况下，冷藏成为保存新蜕壳软壳蟹以维持壳柔软度的通用方法。但值得注意的是，由于酶促自溶和微生物生长，蟹类极易腐败。虽然低温能有效延缓青蟹的腐败过程，但如何更快速地冷却蟹类仍需进一步研究和验证。
流态冰是一种包含微小球形冰颗粒和海水的两相系统，已被证明是快速冷却水产品的有效技术。迄今为止，流态冰已广泛应用于鱼类、虾类和贝类的预冷和保鲜。例如，海水流态冰结合电子束辐照是抑制多酚氧化酶活性、降低pH值、总挥发性盐基氮和总活菌数，并维持南美白对虾良好感官品质的更好方法。此外，使用负载茶多酚的壳聚糖/果胶纳米粒子作为成核剂的流态冰，也能根据理化指标有效延长大黄鱼的货架期。因此，流态冰似乎能有效快速冷却水产品；将其用于软壳蟹的冷藏是值得尝试的。
本研究全面分析了软壳青蟹肌肉在流态冰冷却和冷藏期间K值、黄嘌呤氧化酶（XOD）、游离氨基酸（FAAs）和风味核苷酸的演变。同时，利用16S rRNA基因扩增子测序技术研究了肌肉细菌群落的多样性和组成。本研究旨在揭示：（1）真空包装软壳青蟹在流态冰冷却和冷藏期间品质特性的演变；（2）真空包装软壳青蟹肌肉细菌群落的演替；以及（3）使用流态冰冷却和冷藏进行真空包装软壳青蟹短期保鲜的可行性。
2 材料与方法
2.1 软壳蟹的制备
从中国浙江宁波水产品交易市场购买了60只附肢完整的双壳青蟹（每只约200克）。使用保温泡沫箱在环境温度约25°C的干燥条件下，2小时内运至实验室。每只蟹被单独饲养在一个塑料篮中，并覆盖透明亚克力板以防止个体间相互残杀并便于观察。将蟹随机分配到六个饲养池中，每个池300升天然海水。饲养海水持续曝气并维持在以下条件：温度28–30°C，pH 8.0–8.1，盐度18–20‰，溶解氧5–6 mg/L。每日更换30%的水以维持水质。在整个暂养期间不投喂饲料，以确保后续软壳阶段的水体清洁。在饲养池上方安装了监控摄像头，以便及时获取新蜕壳的蟹。
2.2 冰点温度测定
将六只软壳蟹在冰水浴中固定3分钟。将微型温度记录仪的探头插入每只蟹的头胸甲，然后将蟹置于-20°C环境中。基于从六只蟹获得的冻结曲线，确定软壳蟹的冰点温度为-1.5°C。
2.3 流态冰的制备
将天然海水冷却至其冰点。随后，添加二氧化钛（TiO2）纳米粒子（锐钛矿型，标称粒径5 nm）作为成核剂，浓度为流态冰总质量的1%（w/w）。为达到最终两相组成（80%冰和20%液态海水，按质量计），在冷却过程中使用机械搅拌器剧烈搅拌部分冻结的海水。将混合物维持在低温环境中，直至获得致密、可流动且游离液体极少的浆体。制备的流态冰温度被持续监测并维持在-1.5 ± 0.2°C，该温度与先前测定的软壳蟹冰点一致。
2.4 软壳蟹的流态冰冷却与冷藏及样品采集
选取30只软壳蟹，立即在冰水浴中麻醉3分钟。随机指定6只蟹作为对照组（第0天）。剩余24只蟹使用高密度聚乙烯袋进行独立真空包装。选择HDPE是因为其有效的阻隔性能，可防止蟹与流态冰直接接触。每只真空包装的蟹随后被放入聚丙烯塑料容器中，完全嵌入流态冰。使用足量的流态冰以确保蟹被完全包围，流态冰与蟹的体积比约为3:1。容器在4°C的冰箱中储存。在7天的储存期内，未更新或补充流态冰。所有实验程序均遵循宁波大学动物研究所委员会指南。在指定时间点取样，每个时间点从六个生物学重复中收集肌肉组织。肌肉样品专门从头胸甲的胸肢解剖获得。选择肌肉组织进行分析，不仅因为它是蟹的主要可食用部分，还因为其K值是青蟹新鲜度的最佳指标。所有样品在液氮中快速冷冻并储存在-80°C直至进一步分析。
2.5 酶活性测定
肌肉组织样品（0.1克）在0.9毫升冰冷的0.9%盐溶液中匀浆。匀浆液在4°C、3000 rpm下离心10分钟。收集上清液用于后续酶活性测定。使用商业测定试剂盒测定黄嘌呤氧化酶（XOD）活性。进行了六个生物学重复。
2.6 K值测定
使用纸电泳法测定蟹肌肉的K值。简而言之，1克肌肉组织用600微升提取试剂A匀浆。匀浆液随后使用提取试剂B和C中和。此后，将3毫升所得上清液进行纸电泳，并据此计算K值。需注意的是，该方法得出的K值是基于肌苷酸（IMP）和次黄嘌呤与总ATP相关化合物比值的复合指标。本研究未对ATP降解途径中三磷酸腺苷（ATP）及其直接前体（如ADP）的个体水平进行量化。
2.7 氨基酸测定
氨基酸通过超高效液相色谱-串联质谱法进行分析。简而言之，称取约10毫克肌肉组织，与30微升氨基酸内标溶液混合。然后加入470微升冰甲醇-水溶液，在剧烈涡旋下提取两次。合并的上清液用5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯衍生化以标记氨基。冷却至室温后，加入2微升甲酸。溶液通过0.22微米膜过滤并进行分析。
2.8 风味核苷酸测定
风味核苷酸通过高效液相色谱法测定。约250毫克肌肉组织在1.5毫升10%高氯酸中匀浆并超声处理10分钟。匀浆液在4°C、12000 rpm下离心10分钟，收集上清液。残渣按相同程序重新提取。合并的上清液用含0.05 mol/L磷酸的甲醇-水溶液稀释至5毫升，并通过0.22微米注射器过滤器过滤。
2.9 味觉活性值与等效鲜味浓度
味觉活性值（TAV）计算公式为风味化合物的浓度（C）与其对应味觉阈值（T）的比值，即C/T。TAV≥1的化合物被认为对风味有显著贡献。使用的味觉阈值（T）值为：谷氨酸（Glu）30 mg/100 mL，天冬氨酸（Asp）100 mg/100 mL，单磷酸腺苷（AMP）50 mg/100 mL，肌苷酸（IMP）25 mg/100 mL，鸟苷酸（GMP）12.5 mg/100 mL。
等效鲜味浓度（EUC）以每100克样品中谷氨酸钠（MSG）的克数表示。根据以下公式计算：
Σaibi+ 1218(Σaibi)(Σajbj)
其中，ai指天冬氨酸（Asp）或谷氨酸（Glu）的浓度；bi指Asp（0.077）或Glu（1）的相对鲜味系数；aj指AMP、IMP或GMP的浓度；bj指AMP（0.18）、IMP（1）或GMP（2.3）的相对鲜味系数；1218指协同相互作用常数。
2.10 DNA提取、16S rRNA基因扩增与Illumina测序
使用土壤DNA试剂盒从500毫克蟹肌肉组织中提取基因组DNA。使用NanoDrop ND-2000分光光度计评估所得DNA的浓度和纯度。使用引物对338F和806R扩增细菌16S rRNA基因的高变V3-V4区。在25微升总体积中进行PCR扩增。热循环程序如下：95°C初始变性3分钟；随后进行30个循环：95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸45秒；最后72°C延伸10分钟。为最小化扩增偏差，每个样品进行三次PCR。所得扩增子经纯化、片段大小评估、定量并按等摩尔比混合。在Illumina Nextseq2000平台上进行测序以生成双端读长。
2.11 统计分析
所有统计分析均使用R软件进行。对于大多数数据集（包括微生物群落数据、酶活性和其他未指定指标），组间差异使用Kruskal-Wallis检验评估，并进行Benjamini-Hochberg p值校正。FAA数据使用单因素方差分析，随后进行Duncan多重范围检验。使用三种非参数多变量方法（MRPP、ANOSIM和Adonis）基于Bray-Curtis相异度评估细菌群落组成的差异。使用主坐标分析可视化聚类分布。在ASV水平进行指示物种分析。所有可视化均使用ggplot2包生成。数据以平均值±标准差呈现，p < 0.05被认为差异显著。
3 结果
3.1 K值与XOD活性的变化
测量肌肉K值以评估冷藏软壳蟹新鲜度的变化。结果表明，在整个冷藏期间，K值持续增加，从第0天的15.72 ± 2.13%上升到第7天的32.52 ± 4.02%。
软壳蟹肌肉的XOD活性在第3天出现显著增加，并在第7天再次出现显著增加。
3.2 游离氨基酸的变化
在软壳蟹肌肉中鉴定出20种氨基酸，包括两种鲜味氨基酸（UAAs）、五种甜味氨基酸（SAAs）、十种苦味氨基酸（BAAs）和三种无味氨基酸。在17种FAAs中，甘氨酸（Gly）和精氨酸（L-Arg）的浓度超过500 mg/100 g。丙氨酸（L-Ala）和谷氨酸（L-Glu）的含量分别为283.96 ± 26.92 mg/100 g和201.23 ± 78.48 mg/100 g。其余氨基酸的浓度主要低于25 mg/100 g，脯氨酸（L-Pro，53.44 ± 21.14 mg/100 g）除外。
FAA组成谱受储存时间影响，其特征是最丰富和具有代表性的FAAs，包括L-Glu、Gly、L-Ala和L-Arg显著减少。到第7天，L-Glu含量显著下降至46.12 ± 6.93 mg/100 g，其TAV值从6.71降至1.54。同样，Gly和L-Ala的含量也显著下降，其TAV值在储存期间分别从4.04降至1.15和从4.73降至2.23。此外，L-Arg的浓度也大幅下降，其TAV从10.38降至4.26。组胺（L-His）的TAV从1.17降至0.75。对于所有其他氨基酸，在整个研究期间TAV值均保持在1以下。相应地，UAA、SAA和BAA的含量分别下降了67.4%、61.0%和46.4%。总氨基酸（TAA）含量从2018.29 ± 301.25 mg/100 g显著下降至881.36 ± 233.45 mg/100 g。相比之下，必需氨基酸（EAA）含量在储存期间增加了5.5%。
3.3 风味核苷酸的变化
在软壳蟹肌肉中，AMP被确定为AMP、IMP和GMP中最丰富的核苷酸。冷藏后，其含量总体呈下降趋势，并从第3天起显著低于初始水平。IMP的变化趋势与AMP相似，但在整个储存期间未检测到显著差异。相比之下，GMP的含量逐渐增加，并从第5天起显著高于初始水平。同时，肌肉的EUC在7天储存期内下降了85.65%。
3.4 细菌群落的演替
Shannon指数显示在储存期间各时间点无显著差异。PCoA分析揭示了在整个冷藏期间细菌群落结构演替呈现P形轨迹。相异性分析表明，第0天取样的蟹与第3-7天取样的蟹之间存在显著差异，第1天取样的蟹与第3-5天取样的蟹之间也存在显著差异。
1% at least in one group; (D) dynamics of dominant families with average relative abundance > 1% at least one group.">
在储存期间，肌肉组织中的微生物组成发生了显著变化。在门/纲水平上，三个优势类群随时间变化：γ-变形菌纲和α-变形菌纲的相对丰度增加，而芽孢杆菌纲减少。在更细的分类分辨率上也观察到变化，超过20个科（在任何组中>1%）的相对丰度发生了改变；其中，丛毛单胞菌科和希瓦氏菌科表现出显著增加，不动杆菌属、玫瑰弯菌属和希瓦氏菌属等成为最终群落中的优势属。
鉴于在不同储存时间观察到的不同细菌群落，我们进一步研究了与特定时间点相关的关键指示性ASV。共鉴定出25个指示性ASV。其中近一半在新蜕壳的软壳蟹（第0天）中最为丰富，例如两个葡萄球菌属ASV（ASV56和ASV 3246）、一个弧菌属ASV（ASV 757）和一个弓形杆菌属ASV（ASV 1706）。随着储存进行，指示性ASV 1195（归为哺乳动物球菌属）和ASV 388（柄杆菌属）在第1天显示出峰值丰度。另外两个指示性ASV 2481（沉积杆菌属）和ASV 13（嗜酸菌属）在第3天显示出最高的相对丰度。到第5天，八个ASV主导了肌肉细菌群落，例如ASV 1008和ASV 1847。值得注意的是，只有一个指示性ASV 936（希瓦氏菌属）在第7天表现突出。
4 讨论
4.1 储存期间新鲜度下降与质地劣化
K值是评估海鲜新鲜度最广泛使用的生化指标之一。特别是，肌肉K值是青蟹新鲜度的最佳标志物，反映了核苷酸的降解。本研究中观察到的K值在储存期间增加与典型的死后核苷酸分解一致。到第3天，K值达到22.03 ± 2.55%。尽管该值与海水流态冰储存的南美白对虾报告值相当，但它未达到鱼类最严格的新鲜度标准（K ≤ 20%）。这一升高值可能归因于TiO2基海水流态冰在4°C储存期间的融化，这可能损害了冷冻稳定性。尽管如此，到第7天K值仍保持在40%以下，这使其处于水产品“新鲜等级1”范围内，表明可接受的食用品质。需要注意的是，K值主要作为新鲜度评估的生化参考。对可食性和安全性的实际评估必须结合微生物检测、感官评价和卫生处理程序。这支持了流态冰在延长海鲜货架期方面的功效，正如许多研究所记载的那样。尽管使用TiO2作为成核剂引发了对其相关健康风险的潜在安全担忧，但从食品接触材料释放到食品基质中的TiO2纳米粒子的可检测释放通常是最小的，被认为是可忽略的。此外，在远超过我们实验设置中可能暴露水平的剂量下进行的毒理学评估显示，食品级TiO2没有显著健康风险。此外，HDPE屏障可以有效缓解蟹的任何潜在间接暴露途径。因此，在我们的实验条件下，TiO2纳米粒子带来的健康风险非常低，可能可以忽略不计。然而，聚乙烯材料可能略微阻碍了热传递。
XOD活性在第3天和第7天观察到显著增加，标志着新鲜度损失的关键阶段。这与ATP分解的进程一致，其中XOD催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤和尿酸。黄嘌呤的积累本身就是新鲜度下降的既定指标。本研究的一个局限性是未对完整的ATP降解途径进行剖析。未来研究采用高效液相色谱等技术系统量化ATP、ADP、AMP、IMP及其降解产物，将提供对软壳蟹冷藏期间新鲜度演变机制更全面的理解。
4.2 储存期间风味损失
水产品新鲜度下降通常伴随着风味损失。FAAs在鲜味、甜味和苦味等风味属性中起关键作用。关键FAAs（L-Glu、Gly、L-Ala、L-Arg）的显著减少以及TAA含量的下降，表明储存期间风味损失严重。值得注意的是，与苦味相关的L-Arg由于其高初始TAV和显著减少，表现出最显著的影响。同样值得注意的是，SAAs如Gly和L-Ala在高浓度条件下可有助于鲜味。在某种程度上，本研究中观察到的肌肉氨基酸谱与先前在软壳蟹肌肉或混合肌肉-肝胰腺样品中报告的氨基酸谱有所不同。这些差异可能源于地理来源、不同发育阶段和/或组织特异性。
核苷酸是青蟹肌肉中另一大类风味活性化合物。鉴于AMP和IMP在青蟹中的高丰度，以及它们与氨基酸协同作用增强鲜味感知，选择这两种核苷酸以及另一种鲜味核苷酸GMP来探索冷藏期间风味核苷酸的变化。我们的结果显示，AMP是软壳蟹肌肉中这三种核苷酸中最丰富的，这与硬壳蟹的研究结果一致。IMP的变化趋势与AMP相似，但在整个储存期间未检测到显著差异。在冷藏虾中也报告了AMP和IMP水平的类似下降。AMP和IMP都是已知的味精样味道增强剂，味觉阈值分别为50 mg/100 mL和25 mg/100 mL。因此，两种核苷酸都对整体风味特征有重要贡献。相比之下，GMP由于其含量保持在其味觉阈值以下，对风味影响不显著。
需要注意的是，鲜味核苷酸在与鲜味氨基酸结合时，在增强鲜味方面表现出协同效应，可通过EUC量化。我们观察到肌肉EUC在7天储存期内下降了85.65%，这一趋势与在较高温度下报告的三疣梭子蟹肌肉EUC值升高以及青蟹可食用组织的EUC值变化一致。值得注意的是，软壳蟹肌肉的EUC值远高于来自海水或盐碱环境的硬壳蟹的EUC值。尽管EUC在储存期间下降，但仍高于硬壳蟹的EUC值，表明流态冰冷却和冷藏有助于将软壳蟹的鲜味保持长达7天。然而，需要注意的是，虽然这些化学指标是感官属性的既定预测因子，但未来研究应包括直接的人类感官评价，以充分验证储存蟹的味觉品质和总体可接受性。
4.3 细菌群落与品质的密切关系
腐败细菌的增殖是海鲜品质劣化的主要驱动因素。我们的微生物分析详细检查了软壳蟹在7天储存期内细菌群落的动态。虽然由于冷藏导致的细菌α多样性降低在蟹酱、鮟鱇鱼和大黄鱼等产品中常见，但本研究中α多样性未出现显著下降，表明软壳蟹在整个储存期间保持了相对多样的细菌群落。这可能归因于使用了流态冰冷却。在PCoA中观察到的P形轨迹，连同特定时间点的显著相异性，反映了动态的生态演替——尽管不如青蟹肌肉或蟹酱中报道的那样明显。
优势细菌门/纲的变化以及特定科丰度的增加表明微生物对储存条件的适应。指示物种的时间变化进一步表明肌肉细菌群落内部存在结构化的生态演替。降低的真空水平和低储存温度可能对细菌生存施加了选择压力，这与“适者生存”原则一致。值得注意的是，存在于新蜕壳软壳蟹中的12个指示性ASV似乎不太适应真空和寒冷环境。有趣的是，一个被鉴定为弧菌属的ASV在整个储存期间受到抑制。虽然低温（4°C）本身通常不足以抑制弧菌生长，但真空包装可能有助于抑制它。这与先前在真空包装牡蛎中的发现一致，在冷冻储存期间，其创伤弧菌水平显著低于有氧储存的样品。
随着储存的进行，除了ASV936（归为希瓦氏菌属）外，没有典型的腐败细菌成为优势菌，该ASV在第7天显著增加。希瓦氏菌属包含大约70种革兰氏阴性菌，其中腐败希瓦氏菌是各种海鲜（包括鱼和虾）中已知的耐低温腐败微生物。低温可以促进希瓦氏菌物种的生物膜形成，增强其环境适应性并抑制竞争者。与希瓦氏菌相关的腐败已在真空包装海鲜中有记录。此外，腐败希瓦氏菌已被证明可加速真空包装冷藏大黄鱼鱼片中IMP的降解。因此，腐败希瓦氏菌丰度的增加被认为是海鲜品质下降的指标。本研究中ASV936的增加表明，到第7天软壳蟹可能已经开始腐败。
5 结论
本研究调查了真空包装软壳蟹在流态冰冷却储存期间肌肉品质特性和细菌群落组成的变化。K值保持在40%以下，表明基于该生化指标，蟹在七天的储存期内保持了可接受的新鲜度。同时，XOD活性随时间增加。Gly、L-Arg、L-Ala和L-Glu被确定为肌肉中最丰富和最具代表性的FAAs。这四种FAA在储存期间下降，似乎在塑造冷藏软壳蟹的风味特征中发挥了主要作用。在风味相关的核苷酸中，AMP是最丰富的。AMP和IMP在储存期间含量总体下降，但仍对整体风味有重要贡献。值得注意的是，EUC也随着储存时间的延长而下降。此外，肌肉中的细菌群落在α多样性方面未出现显著变化，但四个科（主要是丛毛单胞菌科和希瓦氏菌科）的相对丰度增加。被归类为希瓦氏菌属的ASV936的增加表明，腐败可能在第7天开始。总之，这些结果表明，流态冰冷却结合冷藏提供了一种可行且有效的方法，可在7天的储存期内维持软壳蟹的食用品质。未来的工作将包括与传统方法（如片冰）的直接比较，以更好地量化流态冰储存的优势，同时专注于识别导致品质下降的关键腐败细菌。
