1 引言
线粒体代谢重编程已成为癌症进展的标志。尽管经典的Warburg效应强调了糖酵解表型，但越来越多的证据表明，在特定癌症亚型（尤其在转移过程中）中，线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）的依赖性和活性反而增强，以维持高水平的线粒体三磷酸腺苷（mitoATP），从而驱动肿瘤增殖、转移和化疗抵抗。因此，靶向线粒体代谢、耗竭mitoATP成为一种有前景的抗癌策略。然而，其发展面临根本性的测量障碍：传统基于荧光素酶-荧光素的ATP检测方法因破坏性样本处理而引入误差；荧光探针则受限于细胞区室间的信号串扰以及传统荧光显微镜固有的分辨率限制（>200 nm），无法实现单线粒体分析。此外，线粒体群体固有的异质性（如动态融合-分裂过程产生代谢不同的亚群）进一步阻碍了准确评估。这些限制严重阻碍了药物开发，因为现有平台无法区分线粒体ATP抑制与细胞质ATP干扰，以及化合物对其他细胞器的脱靶效应。因此，迫切需要一种具备严格线粒体特异性、能够进行单细胞器mitoATP定量的精确分析工具，以推动针对OXPHOS依赖性癌症的疗法发展。
本研究中，研究人员通过将实验室自建的纳米流式细胞仪（nFCM）与一种氟化ATP探针（ATP-Red 1）相结合，开发了MitoATP-nFCM平台。该平台旨在解决癌症代谢中长期存在的悖论：尽管Warburg效应主导了教科书范式，但越来越多的证据表明特定情况下存在OXPHOS依赖性。该平台能够实现两大功能：（1）在单细胞器水平定量mitoATP，以明确绘制代谢异质性图谱，揭示协调的重编程特征（膜电位升高、ATP合成酶表达增加、己糖激酶2水平抑制）；（2）精准筛选靶向OXPHOS依赖性癌症的抑制剂，从而弥合代谢表型分析与靶向治疗之间的鸿沟。
2 结果与讨论
2.1 MitoATP-nFCM平台的开发
为建立MitoATP-nFCM平台，研究团队从人乳腺癌细胞（MCF-7）中分离线粒体，并用膜通透性ATP-Red 1探针进行孵育。该探针对生理浓度范围（1–10 mM）内的ATP呈现线性、剂量依赖性的响应，并相较于腺苷二磷酸（ADP）和腺苷一磷酸（AMP）表现出高选择性，且荧光稳定性良好。MitoATP-nFCM实现了单线粒体水平的ATP特异性检测，与对照组相比，ATP-Red 1标记后荧光信号显著增加，并且侧向散射（SSC）与荧光（FL）通道信号一一对应。尽管活细胞成像显示ATP-Red 1主要定位于线粒体，但也观察到少量溶酶体共定位，而使用分离线粒体的平台则规避了这种潜在干扰。在染色过程中，线粒体完整性保持完好，表现为不同探针浓度（0–100 µM）下SSC信号稳定。在20 µM ATP-Red 1浓度下，荧光强度达到饱和（标记效率>90%），该浓度被确定为后续实验的最佳浓度。
为验证线粒体功能，研究团队用ADP或强效线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理分离的线粒体，并用MitoATP-nFCM进行分析。在呼吸条件下，ADP通过电压依赖性阴离子通道（VDAC）穿过线粒体外膜（OMM），并由腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）输入基质，作为ATP合成酶的底物。MitoATP-nFCM分析显示，10 mM ADP处理诱导mitoATP荧光强度增加了2.2倍，且在0–10 mM ADP范围内的剂量依赖性mitoATP荧光增强证实了分离线粒体中保留了OXPHOS功能。相反，100 µM CCCP处理由于膜去极化使mitoATP荧光强度降低了43%，且具有剂量和时间依赖性效应。最后，为排除非特异性结合或结构类似物的干扰，研究团队用ATP的结构类似物AMP（0–10 mM）孵育分离线粒体，结果显示AMP处理未引起mitoATP荧光信号的任何显著变化，证实了所观察到的探针响应是线粒体ATP合成特异性的，而非与细胞器成分非特异性相互作用的假象。总之，这些结果表明，MitoATP-nFCM能够以最小的非线粒体干扰实现定量、单细胞器水平的ATP分析，为线粒体靶向药物发现提供了一个强大工具。
2.2 癌细胞在单线粒体水平表现出增强的OXPHOS活性
为了研究线粒体代谢在肿瘤生长和增殖中的作用，研究团队使用MitoATP-nFCM平台对人乳腺永生化上皮细胞（MCF-10A）、MCF-7和三阴性乳腺癌细胞（TNBC，MDA-MB-231）分离的线粒体进行了比较分析。引人注目的是，两种癌细胞系的mitoATP水平均显著升高，其中MCF-7比MCF-10A对照组升高了1.8倍，MDA-MB-231则升高了1.9倍。这些定量测量强调了线粒体OXPHOS在乳腺癌进展中的关键作用。
在线粒体内，三羧酸（TCA）循环、ATP合成酶（复合物V）和电子传递链（ETC）协同作用以驱动高效的mitoATP生成。在OXPHOS中，线粒体通过ETC活性维持高膜电位（Δψm ）为ATP合成提供动力。相比之下，糖酵解始于己糖激酶（HK）催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）。在HK亚型中，HK2通过与VDAC相互作用结合到OMM上，并接近线粒体内ATP，从而促进糖酵解。为了进一步验证癌细胞中观察到的向OXPHOS转移的代谢转变，研究团队采用nFCM对线粒体Δψm 和蛋白质表达（ATP合成酶和HK2）进行了单细胞器测量。定量分析显示，癌细胞的线粒体Δψm 比正常对照高1.4倍。此外，ATP合成酶水平显著增加，MCF-7相对于MCF-10A对照增加了61%，而MDA-MB-231则最为显著，增加了106%。相反，恶性细胞中的HK2蛋白表达显著降低，MCF-7细胞降至正常水平的59%，MDA-MB-231细胞降至74%。这些发现明确确立了乳腺癌细胞倾向于使用OXPHOS主导的生物能量学，而非HK2介导的糖酵解途径来满足其能量需求。
为了探究这种细胞器水平的代谢重编程是否在其他细胞系中保守存在，研究团队将MitoATP-nFCM分析扩展至从正常人结肠成纤维细胞（CCD-18Co）和两种结肠癌细胞系（HCT-15和HCT-116）中分离的线粒体。结果显示出显著的一致性，MitoATP-nFCM显示两种结肠癌细胞中的mitoATP水平均显著高于正常的CCD-18Co细胞，其中HCT-15和HCT-116细胞分别增加了1.7倍和1.8倍。结肠癌细胞中Δψm 升高、ATP合成酶蛋白表达上调和HK2水平降低进一步验证了这种增强的线粒体代谢活性。
值得注意的是，传统流式细胞术检测到正常细胞和癌细胞之间的总细胞ATP含量没有显著差异。这一观察结果，结合nFCM发现的每个独立线粒体ATP水平增加约1.7至1.9倍，表明了一种独特的生物能量策略：癌细胞中增强的ATP输出很可能是通过上调OXPHOS来提高现有线粒体的效率实现的，而不是通过增加线粒体生物发生。综上所述，MitoATP-nFCM揭示OXPHOS增强在乳腺癌和结肠癌细胞中持续存在。这种保守的代谢重编程在单细胞器水平展示了增强的OXPHOS能力，表明Warburg效应的主导地位可能并不适用于所有癌症谱系。重要的是，这些发现将耗竭mitoATP定位为治疗OXPHOS依赖性癌症的可行策略。
2.3 MitoATP-nFCM识别癌细胞对ATP合成酶抑制的特异性脆弱性
鉴于研究团队在单线粒体分辨率下观察到癌细胞中ATP合成酶表达上调，他们通过MitoATP-nFCM开发了一种药物筛选策略，以探索线粒体ATP合成酶作为潜在的抗癌靶点。研究团队用寡霉素A（OligA，一种ATP合成酶F0 亚基c环的选择性抑制剂，也能诱导Δψm 超极化，用作阳性对照）处理MCF-7细胞。MitoATP-nFCM分析显示mitoATP水平呈剂量依赖性降低，确定50 µM OligA为后续筛选的最佳浓度。正如预期，OligA处理诱导了Δψm 的剂量依赖性增加，证实了MitoATP-nFCM测量结果独立于Δψm 的改变。
为了比较ATP合成酶抑制在恶性细胞与正常细胞中的治疗潜力，研究团队评估了OligA和bedaquiline（BDQ，一种靶向ATP合成酶c和a亚基的FDA批准的抗菌药物）。MitoATP-nFCM分析显示，这两种抑制剂均未改变正常MCF-10A细胞的mitoATP水平，但均显著抑制了癌细胞中的mitoATP，这可能归因于恶性细胞中更高的ATP合成酶丰度。引人注目的是，BDQ显示出比OligA更优的效力，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中分别将mitoATP降至未处理对照的46%和56%，表明其具有癌细胞选择性。这一趋势也延伸至结肠癌模型，BDQ分别使HCT-15和HCT-116细胞的mitoATP相对于未处理对照降低了49%和51。总之，MitoATP-nFCM平台揭示了具有更高mitoATP水平的癌细胞对ATP合成酶抑制表现出更高的敏感性，并强调了BDQ作为一种有前景的线粒体靶向治疗药物的潜力；重要的是，观察到的分子表型与功能反应之间的这种高度一致性验证了筛选方法的准确性和生物学相关性。
2.4 MitoATP-nFCM描绘癌症选择性电子传递链抑制
线粒体ETC是通过维持OXPHOS来驱动肿瘤进展的核心，这是一种与我们单细胞器分析中观察到的mitoATP水平升高在机制上相关的代谢适应。Δψm 升高的观察结果进一步表明癌细胞中ETC活性增强。利用已建立的MitoATP-nFCM平台，研究团队评估了三种ETC抑制剂：鱼藤酮（复合物I）、二甲双胍（复合物I）和VLX600（一种靶向ETC复合物I、II和IV的铁螯合剂）。值得注意的是，MitoATP-nFCM分析表明，鱼藤酮在恶性细胞（MCF-7和MDA-MB-231）和正常细胞（MCF-10A）中均引起显著的mitoATP降低，这与其广泛的毒性一致。相比之下，二甲双胍和VLX600表现出癌症选择性效应，对正常细胞影响最小，同时有效抑制乳腺癌细胞中的mitoATP。这种选择性可能源于Δψm 依赖的药物在线粒体中的积累。值得注意的是，二甲双胍在50 µM浓度下实现了显著的抑制，该浓度显著低于典型的细胞处理剂量（毫摩尔范围）。这意味着靶向线粒体可能通过以较低浓度达到疗效并减少全身副作用来扩大二甲双胍的治疗窗口。VLX600表现出更优的效力，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中分别将mitoATP降至基线的52%和58%。这些差异效应也在结肠癌模型中得到证实，VLX600分别将HCT-15和HCT-116癌细胞中的mitoATP降至对照的49%和55。总而言之，MitoATP-nFCM提供了一个细胞器分辨的平台来评估癌症靶向性ETC抑制剂，这是开发具有最小化全身毒性的精准疗法的关键一步。
2.5 MitoATP-nFCM区分谷氨酰胺驱动TCA循环代谢的癌症选择性抑制剂
癌症代谢中的一个关键问题是，当糖酵解受损时肿瘤如何适应。基于观察到的低糖酵解（HK2表达降低）但高mitoATP的癌细胞特征，研究团队假设通过替代性TCA循环底物进行的代谢重编程可能补偿糖酵解缺陷。鉴于其已确定的与OXPHOS偶联的TCA循环的参与，谷氨酰胺代谢可能发挥关键作用。谷氨酰胺酶（GLS）催化的谷氨酰胺转化为谷氨酸，以及α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）催化的α-酮戊二酸氧化脱羧为琥珀酰辅酶A，代表了TCA循环中的关键调控步骤。为了验证这一点，研究团队系统地评估了四种靶向谷氨酰胺驱动TCA循环代谢的抑制剂：两种pan-GLS抑制剂（BPTES和C-968）、一种GLS1选择性抑制剂（CB-839）和一种双效抑制α-KGDH及丙酮酸脱氢酶（PDH）的硫辛酸类似物（CPI-613）。在单线粒体分辨率下，研究团队发现了显著的差异：BPTES和C-968广泛抑制了正常（MCF-10A）和癌变（MCF-7和MDA-MB-231）线粒体中的mitoATP，而CB-839和CPI-613则显示出显著的癌症选择性。值得注意的是，CPI-613表现出最优的效力，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中分别将mitoATP降至未处理对照的46%和49%。这种癌症选择性抑制在结肠模型中得到了复现，CPI-613再次显示出最大的效力，分别将HCT-15和HCT-116癌细胞线粒体中的mitoATP降至对照的50%和45%。这些发现确立了MitoATP-nFCM作为一个稳健的平台，可用于区分广谱TCA抑制剂（BPTES和C-968）与癌症选择性药物（CB-839和CPI-613）。CPI-613的卓越性能可能源于其对α-KGDH的抑制，α-KGDH将TCA循环与ETC耦合起来。这种独特的机制强调了其对抗通过利用替代性TCA循环底物表现出补偿性代谢可塑性的OXPHOS依赖性癌症的治疗潜力。
3 结论
本研究通过确定线粒体ATP生产（而非糖酵解）作为其代谢脆弱性节点，重新定义了靶向OXPHOS驱动癌症的治疗策略。通过开发MitoATP-nFCM，研究实现了三个变革性的进展：（1）单细胞器分辨率下解析正常与恶性线粒体之间的代谢异质性，揭示了传统批量检测无法发现的癌细胞生物能量特征；（2）定量验证了癌细胞相较于正常细胞对线粒体代谢扰动具有更高的脆弱性；（3）建立了一个用于精准筛选线粒体代谢靶向抑制剂的稳健框架，能够快速识别具有最佳治疗指数的化合物。这些突破不仅确立了mitoATP耗竭作为治疗OXPHOS依赖性癌细胞的有前景策略，而且弥合了细胞器水平代谢表型分析与靶向药物发现之间的关键鸿沟。该平台独特的能力能够区分癌症选择性抑制剂（如BDQ、VLX600、CPI-613）与广谱药物，既为理解癌症中线粒体代谢依赖性提供了机制蓝图，也为开发具有增强肿瘤特异性和降低全身毒性的下一代疗法提供了实用路线图。重要的是，这种方法可以扩展到癌症以外的其他涉及线粒体功能障碍的病理学领域，使MitoATP-nFCM成为推进跨多种疾病领域精准医学的多功能平台。
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