1. CAR-T设计核心原理与迭代演变
CAR-T疗法的核心在于合成受体CAR的设计，其将抗原识别、T细胞激活和共刺激信号整合到单一模块化结构中。CAR的基本结构包括源自单克隆抗体的细胞外抗原结合域（通常为单链可变片段scFv）、提供灵活性的铰链区、提供稳定性的跨膜结构域以及启动T细胞激活的细胞内信号域（CD3ζ）和通过共刺激分子增强功能的区域，如CD28或4-1BB。早期的第一代CAR仅依赖CD3ζ结构域，由于T细胞快速耗竭而表现出短暂的抗肿瘤活性。第二代设计整合了共刺激结构域以解决持久性和细胞毒性问题，例如CD28结构域通过糖酵解代谢通路驱动即时效应反应，而4-1BB结构域则通过氧化磷酸化支持长期生存，这为血液恶性肿瘤的临床成功奠定了基础。为应对实践中遇到的耐药机制，后续CAR-T代次不断演进。例如，为应对B细胞恶性肿瘤中抗原逃逸这一导致复发的主要原因，开发了如CD19/CD22双特异性构建体等双靶向CAR，以扩大抗原覆盖范围。同时，针对实体瘤的免疫抑制肿瘤微环境(TME)，设计了能够分泌免疫调节细胞因子（如白介素-2[IL-2]）或表达检查点抑制剂的第四代CAR（TRUCKs），以对抗基质屏障和免疫逃逸。第五代CAR进一步整合了缺氧响应性JAK-STAT信号模块，使其在实体瘤特有的缺氧条件下能够增强激活。尽管有这些进展，第二代CAR仍是超过80%临床试验的支柱，突显了在平衡创新与规模化生产及安全性方面持续的转化挑战。
2. CAR-T耐药机制
CAR-T疗法在血液肿瘤中展现了显著疗效，例如在复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤中，总体缓解率和完全缓解率分别达到77%和57%。然而，实体瘤的治疗仍面临重大挑战，例如CLDN18.2靶向CAR-T在胃/胃食管结合部腺癌中的总体缓解率为54.9%，但受限于肿瘤异质性和TGF-β介导的免疫抑制。GD2-CAR-T在神经母细胞瘤中的总体缓解率为36.8%，63%的患者因抗原丢失而复发。Gucy2C-CAR-T在结直肠癌中的总体缓解率仅为26.3%，主要受限于微环境代谢障碍，如ATP6V0A1依赖性胆固醇代谢。为应对这些挑战，以下将详细阐述CAR-T的耐药机制。
2.1 肿瘤源性耐药因素
肿瘤细胞的内源性耐药机制主要包括靶抗原丢失、抑制性配体表达、凋亡通路受损和谱系转换。常见的“抗原阴性逃逸”机制涉及肿瘤细胞通过下调或丢失靶抗原表达来逃避免疫识别和杀伤。例如，在CD19 CAR-T治疗中，选择性剪接可导致关键表位丢失，使CD19蛋白无法被CAR-T识别。此外，肿瘤细胞可能表达抑制性配体如PD-L1或CD80，它们会抑制CAR-T细胞活化并诱导其耗竭。CD58表达缺失也会损害CAR-T细胞的细胞毒性。约25%的DLBCL病例存在CD58突变或表达缺失，显著削弱CAR-T细胞的活化和功能。肿瘤细胞还通过上调抗凋亡蛋白或激活促生存通路来增强其对CAR-T杀伤的抵抗。CRISPR-Cas9等基因编辑技术已被用于全基因组筛选，以识别其缺失会赋予CAR-T治疗耐药性的基因。例如，干扰素-γ受体信号通路（IFNγR）中基因的缺失会使得胶质母细胞瘤细胞对CAR-T介导的杀伤更具抵抗力。同样，在三阴性乳腺癌模型中，肿瘤内在的CD28可以稳定Cd274 mRNA，导致PD-L1表达增加和免疫逃逸。
2.2 CAR-T细胞自身因素导致的治疗抵抗
自体CAR-T细胞的生产过程漫长而复杂，通常需要数周，在此期间患者必须等待其个性化CAR-T产品的生成。此外，患者年龄、基础疾病和采集前T细胞状态等多种因素可能损害所产CAR-T细胞的质量和疗效。例如，患有血液恶性肿瘤的患者通常表现出衰老或功能受损的T细胞，这可能导致CAR-T产品的治疗效果欠佳。尽管在血液肿瘤的CAR-T临床试验中总体缓解率和完全缓解率通常很高，但30%–60%的患者会因CAR-T细胞持续性有限或抗原逃逸而复发。研究表明，T细胞耗竭可能在CAR-T治疗失败中起主要作用。耗竭的T细胞的特征是检查点分子和激活标志物的表达以及效应功能的缺陷。研究发现，在非应答患者的CD19 CAR-T细胞中常可观察到耗竭表型。单细胞RNA测序也显示，与获得完全缓解的患者相比，部分缓解或疾病进展患者的CD19 CAR-T输注产品中耗竭特征富集。输注的CAR-T细胞持续性不足是其疗效的关键限制因素之一。CAR-T细胞从初始状态分化为效应或记忆状态对其长期有效性至关重要，但在许多患者中，CAR-T细胞未能分化为记忆样细胞。这种失败常因持续的抗原刺激和IL-10、TGF-β等免疫抑制细胞因子的存在而加剧，它们会促进PD-1、LAG3和TIM3等抑制性受体的表达，导致T细胞耗竭。除了持久性和耗竭的挑战，CAR-T细胞还可能存在肿瘤杀伤能力不足的问题。这种细胞毒性的减弱可能源于多种肿瘤相关因素，包括免疫逃逸机制，以及TME本身带来的代谢和免疫抑制障碍。低氧、营养缺乏和免疫抑制细胞因子积累等因素会抑制CAR-T细胞的活化和效应功能。此外，CAR-T活性延长虽可提高抗肿瘤疗效，但也可能加剧与全身性炎症和细胞因子释放综合征相关的血液学毒性。持续性的CAR-T增殖会放大炎性细胞因子水平，损害造血干细胞功能，延迟血细胞计数恢复。中性粒细胞减少相关感染仍是CAR-T受者中非复发死亡的主要原因。治疗并发症还包括细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征。CRS由CAR-T细胞激活及随后大量细胞因子释放引发，可导致全身性炎症反应。一些接受CAR-T治疗的患者可能发展为噬血细胞性淋巴组织细胞增多症，其临床表现和实验室检查结果与严重CRS相似。最后，虽然自体CAR-T是目前的标准方法，但同种异体CAR-T疗法（T细胞来源于供体）带来了移植物抗宿主病的风险。通过基因编辑技术创建“现货型”CAR-T产品有助于降低此风险。
2.3 肿瘤免疫微环境(TIME)对CAR-T细胞活性的抑制作用
TME对CAR-T细胞疗法构成重大挑战，尤其是在实体瘤中，因其高度免疫抑制性和复杂构成。低氧、营养竞争、免疫抑制细胞和物理屏障等因素共同阻碍了CAR-T细胞的扩增、浸润和持续存在，最终降低疗效。肿瘤内部的低氧和低压力条件通过抑制糖酵解和线粒体氧化磷酸化来损害CAR-T细胞的增殖和干性，这两者对能量产生都至关重要。低氧还会诱导抑制性分子如低氧诱导因子(HIF)的表达，从而促进CAR-T细胞耗竭。同时，肿瘤细胞与CAR-T细胞之间对有限资源（如氨基酸、糖类和脂质）的竞争进一步损害了CAR-T细胞的功能。肿瘤细胞通过上调营养转运蛋白和代谢酶来与CAR-T细胞竞争，剥夺其必需营养，诱发代谢应激。此外，代谢副产物如乳酸的积累加剧了免疫抑制环境，降低pH值并损害CAR-T细胞存活。调节性T细胞和髓源性抑制细胞等免疫抑制细胞的存在进一步抑制了CAR-T细胞活性。Tregs通过分泌IL-10和TGF-β来抑制增殖和细胞因子产生，而MDSCs则通过产生精氨酸酶-1和活性氧来促进免疫抑制，消耗必需营养并创造抑制条件。除了这些生化障碍，实体瘤特有的物理屏障带来了额外的挑战。癌症相关成纤维细胞和由胶原等结构蛋白组成的致密细胞外基质网络形成了阻碍CAR-T细胞迁移和浸润的物理障碍。这些屏障阻止CAR-T细胞有效到达肿瘤部位，尤其是在基质含量高的实体瘤中。肿瘤基质不仅阻碍浸润，还通过分泌细胞因子和趋化因子促进免疫抑制生态位的形成。
3. CAR-T增强策略
为克服CAR-T治疗相关的各种耐药因素，可采用多种策略来增强其疗效。这些方法旨在应对肿瘤源性和CAR-T特异性挑战，并改造TME以创造对CAR-T细胞更有利的环境。
3.1 改善肿瘤靶向
CAR-T治疗的关键初始步骤是选择合适的CAR靶点。理想的靶点应在肿瘤细胞上高表达，在正常组织中表达极少，以避免脱靶效应。CLL-1、ROR1等靶点已在特定肿瘤类型中显示出特异性。对于实体瘤，间皮素在胰腺癌等领域显示出巨大潜力。然而，肿瘤细胞常下调抗原表达以逃避免疫识别。应对此问题的策略包括使用AIM2激动剂或CRISPR/Cas9技术来增加抗原密度，从而增强CAR-T细胞毒性。此外，能够识别两种不同抗原的双靶向CAR已在克服抗原丢失方面显示出前景。例如，靶向CD19和CD22的CAR-T细胞在复发/难治性非霍奇金淋巴瘤中证明有效，显著降低了肿瘤逃逸风险。为改善疗效并减少脱靶毒性，已开发出靶向HER2和GP100的双特异性CAR-T细胞。另一项创新策略涉及设计具有不同亲和力的CAR，以适应抗原表达水平。高亲和力CAR可以检测低密度抗原，而低亲和力CAR有助于最小化脱肿瘤效应。高肿瘤负荷是另一项挑战，因为它可能加速CAR-T细胞耗竭并降低疗效。桥接治疗，如化疗、放疗或免疫疗法，越来越多地用于在CAR-T输注前降低肿瘤负荷。这种疗法显示出提高缓解率和增强CAR-T细胞性能的潜力。例如，BCL-2抑制剂Venetoclax与CAR-T疗法联用，在诱导肿瘤细胞凋亡方面显示出协同效应。TP53修复剂如APR-246可以恢复TP53功能，触发耐药肿瘤细胞凋亡。最后，整合免疫检查点抑制剂、新型拮抗剂或降解剂的联合疗法为克服耐药性提供了全面的策略。例如，PD-1/PD-L1抑制剂可减轻CAR-T耗竭并增强其持久性，显著提高疗效。
3.2 优化CAR-T设计，增强持久性或功能
优化CAR-T细胞疗法涉及改进CAR结构、调控转录因子介导的信号通路以及整合创新的遗传和化学策略。整合了免疫球蛋白超家族成员（如CD28、ICOS）和肿瘤坏死因子受体超家族成员共刺激结构域的第二代和第三代CAR的开发，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效力和持久性。例如，双特异性c-Met/PD-L1 CAR-T细胞能有效对抗抗原逃逸，并表现出优于单价c-Met CAR-T细胞的抗肝细胞癌活性。此外，PRDM1和NR4A3的双基因敲除已被证明可以减少CAR-T细胞耗竭，增强长期记忆细胞的形成，从而改善多种小鼠模型的抗肿瘤反应。CAR-T疗法的一项关键挑战是CAR-T细胞向肿瘤部位的归巢不足。增强CAR-T细胞向肿瘤的浸润已显示出克服这一限制的潜力。有报道称，同时下调抗HER2 CAR-T细胞中的免疫检查点分子PD-1、TIM3和LAG3，可通过增加CD56基因座的染色质可及性和上调CXCL9、CXCL10和CXCL12等趋化因子来增强其浸润。此外，通过表观遗传修饰在CAR-T细胞中诱导CXCR3表达，已被提出作为改善在表达CXCL9、CXCL10和CXCL11的癌症中肿瘤归巢的策略。为进一步提高CAR-T的安全性和功能性，小分子已被用作CAR-T细胞活性的调控开关。例如，FITC标记的抗体、BTK抑制剂、雷帕霉素诱导的异源二聚化、Rimiducid诱导的同源二聚化和PROTAC调节的蛋白质降解等策略，可以精确控制CAR-T细胞的激活。这些安全开关减轻了靶向/脱肿瘤毒性，减少了不良事件，并拓宽了CAR-T疗法的临床适用性。在同种异体CAR-T疗法中，移植物抗宿主病的风险仍然是一个重大关切。基因编辑和小分子预处理策略可以有效应对这一挑战。例如，CRISPR/Cas9技术已被用于破坏TCRβ基因，消除正常的抗原识别和信号传导功能，从而降低GVHD风险。同样，敲除CTLA-4基因可增强T细胞活化和持久性。通过优化供体细胞选择、转染技术和培养条件，可以生产出具有更强抗肿瘤活性的高质量同种异体CAR-T细胞。这些方法不仅缩短了准备时间和成本，还提高了治疗的一致性和安全性。体内CAR-T诱导的最新进展进一步简化了治疗过程。体内CAR-T疗法消除了复杂的体外细胞收集、工程化和扩增的需要，显著缩短了准备时间并降低了全身毒性。例如，已开发出能够将白血病特异性CAR基因直接递送至宿主T细胞的纳米颗粒，在体内有效诱导CAR表达和肿瘤杀伤活性。类似地，可生物降解的PBAE聚合物纳米颗粒已被证明可将CAR或TCR基因转染到T细胞中，在白血病、前列腺癌和肝癌的小鼠模型中实现了与体外工程淋巴细胞相当的抗肿瘤疗效。通用型（同种异体）CAR-T疗法相较于自体CAR-T也具有显著优势。通用型CAR-T细胞来源于预先工程化的供体T细胞，消除了患者特异性细胞收集和改造的需要，可实现即时的“现货型”供应。这种简化的制造过程减少了治疗等待时间，并使CAR-T疗法能够惠及更广泛的患者群体。
3.3 通过调节肿瘤免疫微环境增强CAR-T细胞疗法
TME表现出复杂的时空变化，并含有多种免疫抑制细胞，它们释放包括一氧化氮和精氨酸酶-1在内的抑制因子，损害CAR-T细胞功能。靶向这些免疫抑制机制是克服耐药性的一个有前景的策略。研究表明，靶向成纤维细胞激活蛋白以抑制MDSC募集，显著增强了靶向claudin18.2的CAR-T细胞对胰腺癌的抗肿瘤效力，这表明整合MDSC靶向方法可以改善CAR-T细胞在实体瘤中的浸润和存活。TME是一个动态的战场，免疫细胞和肿瘤细胞在此争夺主导地位，其中免疫抑制因子导致了免疫检查点抑制剂的原发性或获得性耐药。细胞毒性CD8+T细胞是抗肿瘤免疫的关键介质，常被肿瘤或免疫细胞表达的PD-1和CTLA-4等共抑制分子所抑制。使用免疫检查点抑制剂阻断这些通路在恢复CAR-T细胞活性方面已显示出有希望的结果，抗CTLA-4和抗PD-1抗体的联合应用靶向多个免疫检查点通路，使CAR-T细胞能更有效地杀伤肿瘤细胞。然而，这种方法存在疗效短暂和毒性显著等局限性。此外，肿瘤细胞可以通过上调TIM3和LAG3等替代性免疫抑制受体来逃避免疫监视，这可能限制现有免疫检查点抑制剂的效果。除了血管重塑，通过趋化因子系统增强CAR-T细胞迁移是另一种可行的方法。免疫细胞运输严重依赖于趋化因子梯度，工程化CAR-T细胞表达特定趋化因子受体已被证明可以改善肿瘤归巢。针对趋化因子轴破坏的趋化因子受体激动剂或抑制剂可以进一步增强CAR-T细胞向肿瘤的浸润。例如，调节CXCL12–CXCR4轴在临床前模型中有效克服了基质屏障，改善了肿瘤内定位和治疗效果。改善CAR-T疗效的另一个关键方面在于解决癌症相关成纤维细胞及其产生的促纤维化基质所起的免疫抑制作用。靶向CAFs或破坏细胞外基质成分可以打破物理屏障，增强CAR-T细胞的浸润和疗效。最后，肿瘤诱导的骨髓微环境变化会对CAR-T细胞的扩增和功能产生负面影响。恢复骨髓支持能力的策略，例如使用IL-7或IL-15来提高CAR-T持久性，可以改善其细胞毒活性和耐久性。
3.4 通过整合第三信号增强CAR-T疗法
T细胞激活中的第三信号涉及细胞因子及其受体通过自分泌或旁分泌机制发挥作用。这个过程对于T细胞的克隆扩增及其分化为效应和记忆T细胞至关重要，使其能够执行免疫功能。涉及的常见细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15和IL-21，它们都会影响CAR-T细胞的表型和功能。研究表明，不同的细胞因子组合对CAR-T细胞的扩增、持久性和抗肿瘤活性产生不同的影响。因此，基于细胞因子的疗法已成为通过恢复T细胞效应功能来增强CAR-T疗效的关键辅助策略。例如，IL-2疗法已被批准用于治疗肾细胞癌和转移性黑色素瘤。IL-2信号在维持效应T细胞的细胞溶解活性和增殖方面起着至关重要的作用。然而，最近的研究表明，IL-2也可能促进T细胞耗竭，突显了其潜在的抑制作用。由免疫抑制细胞分泌的TGF-β调节T细胞反应，促进Treg分化，同时抑制IL-2受体表达和IL-2产生。研究表明，阻断TGF-β信号或使用表达sTGFβRIIFc的CAR-T细胞可以增强抗肿瘤反应。此外，IL-15与IL-2共享受体组件和下游信号通路，但显示出独特的优势。研究发现，在IL-15中扩增的CAR-T细胞表现出分化程度较低的T记忆干细胞表型，与在IL-2中扩增的细胞相比，耗竭标志物表达减少，抗凋亡特性增强，增殖能力更优。这表明IL-15通过降低mTORC1活性和维持Tscm表型来促进CAR-T细胞的抗肿瘤活性。其他细胞因子也在优化CAR-T细胞功能方面显示出潜力。IL-7在T细胞和B细胞的发育和存活中起关键作用，并促进效应T细胞向记忆T细胞转变。研究表明，重组人IL-7与杂交Fc融合的长效形式显著促进了CAR-T细胞的扩增、持久性和抗肿瘤活性，从而延长了荷瘤小鼠的生存期。这些发现强调了这些细胞因子在维持和扩增Tscm表型方面的重要性。此外，IL‑4参与Th2细胞分化，可能促进肿瘤生长；然而，通过设计将IL‑4信号重定向至促炎通路的融合受体，有可能增强CAR‑T细胞的抗肿瘤效力。尽管IFN‑γ具有抗肿瘤特性，但它也可能导致肿瘤免疫逃逸。研究表明，同时敲低IL‑6和IFN‑γ的CAR‑T细胞释放的细胞因子更少，为提高CAR‑T治疗的疗效提供了潜在策略。此外，IL‑6在肿瘤发生和进展中起关键作用，并与多种癌症的不良预后相关。研究表明，IL‑6基因敲低的CAR‑T细胞可以增强抗肿瘤反应并延长生存期。然而，在CAR-T细胞扩增过程中组合细胞因子需要仔细调节。研究指出，虽然IL-15/IL-7或IL-15/IL-7/IL-21条件增强了CAR-T增殖，但它们也增加了抑制性受体（如Lag3和2B4）的表达，并降低了CD45RA+CCR7+T细胞的频率。这些发现表明，在CAR-T细胞扩增过程中将IL-7和/或IL-21与IL-15组合，可能会损害IL-15在维持Tscm表型方面的益处。最近的研究进展描述了一种可剪切的抗4-1BB-IL-15融合蛋白，它能同时消耗TME中的Tregs并扩增CD8+T细胞。这种双重作用方法有助于增强CAR-T细胞介导的对晚期癌症的控制。除了细胞因子调节外，代谢重编程已成为通过从根本上影响T细胞命运和功能来提高CAR-T细胞治疗疗效的一个有前景的方法。例如，研究表明，营养代谢调节了耗竭CD8+T细胞的组蛋白乙酰化修饰，直接影响其功能恢复。具体来说，他们的研究证明，从乙酸到柠檬酸的代谢转化调节了T细胞的表观遗传景观，影响了与效应功能相关的基因表达。通过促进ACSS2在CD8+T细胞中的核表达或通过小分子抑制剂抑制ACLY，乙酸利用的代谢重编程显著增强了CAR-T细胞在抑制性TME内的抗肿瘤潜力。
4. 总结与展望
迄今为止，全球已有九种CAR-T疗法获得监管批准，其中六种靶向CD19，三种靶向B细胞成熟抗原。技术演进推动了CAR-T经历了五代发展。除了传统的scFv基CAR构建体外，CAR-T细胞工程的最新进展还催生了纳米抗体基CAR、通用型CAR平台、可切换CAR系统和合成受体设计等替代性受体结构。这些新型结构具有稳定性增强、肿瘤穿透性改善、免疫原性降低以及对CAR-T细胞激活控制更佳等优势。值得注意的是，此类创新在克服传统CAR-T疗法的关键局限性方面显示出前景，包括抗原逃逸、T细胞耗竭和脱靶效应。将这些先进的CAR结构与涉及天然产物的策略相结合，可能会进一步增强CAR-T细胞反应的效力和持久性。由于物理屏障、TME、靶点异质性和脱肿瘤毒性，将CAR-T疗效转化至实体瘤仍然具有挑战性，导致总体缓解率低于30%。新兴策略通过干扰素-γ受体通路调节、CRISPR增强的T细胞功能以及与PD-1抑制剂或溶瘤病毒的联合疗法来解决这些局限性，在胶质母细胞瘤和胰腺癌模型中显示出初步成功。除了肿瘤学领域，CAR-T在自身免疫性疾病中也显示出治疗潜力，靶向CD19的疗法在狼疮患者中诱导了药物无缓解，而针对心脏纤维化的模型显示，通过靶向成纤维细胞的方法可以实现功能恢复，这表明其作为“活细胞治疗剂”具有更广泛的应用前景。未来的发展将集中于三个战略轴心：整合逻辑门控回路、碱基编辑平台和诱导多能干细胞来源的免疫细胞等技术创新，以增强特异性和可及性；通过多重靶向、TME重编程和联合方案扩大适应症，以攻克实体瘤和非恶性疾病；通过自动化制造和通用平台实现工业化优化，以实现成本效益高、可扩展的生产。总之，CAR-T疗法的未来无疑是光明的，有望彻底改变癌症治疗并扩展到其他治疗领域。持续创新和协作努力对于充分实现其潜力并克服前方的障碍至关重要。
