综述：利用蛋白质相分离技术优化生化产品的生产

微生物细胞工厂通过液-液相分离技术克服生物制造成本高、产物毒性大和代谢途径分散等瓶颈，利用动态膜less凝聚体增强微生物抗逆性、优化代谢流并实现人工金属酶的体内组装，为高价值生物基化学品生产提供新策略。

朱晨|曹洪鹏|陈杜梦飞|万彩霞

中南大学生物工程学院，中国湖南省长沙市南庐山路932号，410083

微生物细胞工厂是将在生物经济框架内将木质纤维素生物质转化为燃料和化学品的关键平台。目前的生物生产仍受到微生物对抑制剂和工艺压力的敏感性以及代谢瓶颈的制约，这些瓶颈源于组织不良的代谢途径和有毒中间产物，导致产率、产量和生产效率降低。此外，可获得的生物基化学品种类有限。本文重点介绍了蛋白质液-液相分离（LLPS）作为一种克服这些障碍的强大策略。LLPS是一种普遍存在的生物物理现象，能够形成对细胞功能（如应激反应和代谢通道化）至关重要的动态无膜凝聚体。微生物利用LLPS来抵御多种压力源，并通过局部化酶和底物来提高代谢效率。我们详细评估了如何通过工程化微生物相分离来提高宿主适应性、简化代谢流以增强经济性能，以及实现人工金属酶的体内组装和功能整合。

引言

蓬勃发展的生物经济依赖于强大而高效的微生物细胞工厂（MCFs），将可再生的木质纤维素生物质转化为多种燃料和化学品[1, 2]。尽管具有潜力，但MCF驱动的生物生产常常受到恶劣生物处理条件（例如生物质预处理过程中产生的抑制剂的细胞毒性）[2]的阻碍。此外，合理设计代谢途径以将碳流导向所需产品同时最小化副产物仍然是一个巨大的挑战。此外，虽然现有系统能够有效生产大宗化学品，但要扩展到高价值化学品通常需要将生物催化与非生物催化相结合[3]。然而，非生物催化剂与活体宿主之间的固有不兼容性限制了这些混合应用。

蛋白质液-液相分离（LLPS）为这些瓶颈提供了一种变革性的解决方案。这一过程涉及蛋白质和其他生物分子在细胞内可逆地自组装成不同的无膜凝聚体[4]。这些动态隔室协调了多种细胞过程，包括精确的细胞感知、快速应激反应和高效的代谢通道化[5, 6, 7]。微生物已经进化出利用LLPS作为抵御多种压力源（如干燥、热/冷休克、噬菌体入侵、碳饥饿和微生物间竞争）[8•, 9, 10•]的多功能保护机制。此外，LLPS通过隔离酶和底物来提高代谢效率；通过促进它们之间的接近性并促进通道化，它提高了糖酵解和CO₂固定等自然途径中的反应速率[11, 12]。重要的是，这些微环境可以共定位金属离子催化剂，使其免受细胞干扰[13]。利用这种自然重组能力为增强微生物对抗抑制剂的韧性、精确优化代谢流以及促进体内化学催化剂与生物催化剂的组装提供了一种有前景的工程策略。

在这篇综述中，我们详细探讨了利用蛋白质LLPS提高微生物对不利条件的耐受性以及提高所需生化产物的产量和生产效率的最新进展。特别关注了蛋白质相分离在活细胞中高效组装、稳定和功能整合人工金属酶（ArMs）的创新应用，为新一代高价值生物基化学品的可持续生物合成铺平了道路。

部分摘录

提高微生物细胞工厂的稳健性

木质纤维素生物质的顽固性需要一个严格的预处理步骤来释放可发酵的糖类。然而，这一过程会无意中产生有毒抑制剂，如弱酸、呋喃和酚类物质，这些物质严重阻碍了微生物的生长和代谢。此外，由于高浓度下的最终产物毒性，实现高生产滴度往往适得其反[14]，而工业化放大还会引入污染等额外复杂性

增强生物生产的途径酶组装

产品产量、滴度和生产效率是决定木质纤维素基生物过程经济可行性的关键相互依赖的指标[1, 2, 21]。然而，实现这些指标的高水平经常受到两个普遍存在的瓶颈的制约。首先，酶的分散性质限制了底物的可及性和反应速率，直接限制了生产效率[22]。此外，这种缺乏空间组织的情况使得中间产物容易扩散

人工金属酶的体内组装

扩展生物基化合物及其相关衍生物的库是加速生物经济发展的关键[2]。人工金属酶（ArMs）是通过将非生物金属辅因子整合到蛋白质支架中形成的，从而能够催化补充天然酶功能的非生物反应[41]。当在细胞环境中发挥作用时，ArMs可能会彻底改变代谢工程和合成生物学，促进体内化学品的生产

结论与未来展望

LLPS的战略诱导代表了一种多功能工具包，用于通过克服从木质纤维素生物质生产燃料和化学品过程中的关键挑战来推进MCFs的发展。通过提高微生物对环境压力的抵抗力，蛋白质凝聚体可以用于设计出稳健的宿主细胞，从而提高工艺的可靠性。此外，相分离在体内形成无膜细胞器的能力为各种代谢问题提供了优雅的解决方案

CRediT作者贡献声明

朱晨：概念化、撰写——初稿、撰写——审阅与编辑。曹洪鹏：撰写——审阅与编辑。陈杜梦飞：撰写——审阅与编辑。万彩霞：概念化、撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

朱晨感谢中国湖南省自然科学基金（资助编号2024JJ6522）的财政支持。万彩霞感谢美国农业部国家食品与农业研究所（奖项编号2021-67021-34504）提供的财政支持。我们还要感谢Servier Medical Art（https://smart.servier.com）提供的一些图片。