环状RNA（circRNAs）是一类独特的非编码分子，通过非典型的反剪接事件从前体mRNA外显子中产生。这种合成途径导致它们具有共价闭合的拓扑结构，使其在结构上不同于线性同源异构体（Sanger等人，1976年；Qu等人，2015年；Petkovic等人，2015年）。与线性RNA不同，circRNAs具有保守的反剪接接头（BSJ）位点，并且对RNase具有抗性（Jeck等人，2014年）。作为细胞过程的重要调节因子，circRNAs因其多种功能而受到关注，包括作为强效microRNA（miRNA）拮抗剂、介导基因转录/RNA剪接控制以及与各种RNA结合蛋白（RBPs）形成复合物（Hansen等人，2013年；Memczak等人，2013年）。circRNAs已被证明通过多种机制在调节肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和药物耐药性方面发挥关键作用（Wang等人，2021年；Yu等人，2022年；Ge等人，2021年；Jiang等人，2024年）。circRNAs的异常表达与多种病理状况有关，包括癌症（Conn等人，2024年）、神经退行性疾病（Kondo等人，2020年）和心血管疾病（Mei等人，2022年）。因此，circRNAs成为非侵入性生物标志物检测和癌症直接治疗调节的有希望的候选者。
现有的circRNA检测方法如Northern印迹（Khandjian等人，1986年）、微阵列（Jiang等人，2024年）、荧光原位杂交（FISH）（Yu等人，2022年）和RNA测序（Puri等人，2023年）存在某些局限性。这些方法通常涉及复杂的多步骤协议，需要大量时间和高成本的分析设备及专业人才。这些限制阻碍了这些方法在临床中的广泛应用。因此，迫切需要开发更高效和灵敏的circRNA检测方法，以加深对其生物学特性和作为各种疾病生物标志物潜力的理解。然而，线性RNA的干扰以及circRNAs的微量存在给检测带来了困难。
CRISPR/Cas系统由具有核酸酶活性的Cas效应蛋白及其相应的引导RNA（gRNA/crRNA）组成。该复合体需要原间隔序列（PAM）来识别特定序列的目标并实现初始结合（Hille等人，2018年；Zetsche等人，2015年；Fonfara等人，2016年）。在Cas-crRNA复合体成功捕获目标后，CRISPR-Cas效应蛋白激活非特异性内切酶功能。这种独特的辅助活性导致相邻单链DNA（ssDNA）报告分子的切割，使该系统成为核酸（DNA/RNA）诊断的强大平台（East-Seletsky等人，2016年）。然而，单独使用CRISPR-Cas12a对于精确检测微量circRNAs的灵敏度不足，因此需要整合核酸扩增过程以提高灵敏度（Chen等人，2021年）。
等温扩增方法，如滚环扩增（RCA）（Liu等人，2020年；Wang等人，2023年）、环介导的等温扩增（LAMP）（Song等人，2022年；Li等人，2023年）、链置换扩增（SDA）（Wu等人，2024年）和重组酶聚合酶扩增（RPA）（Zhao等人，2023年），受到了广泛关注。这些方法能够在单一恒定温度下高效扩增目标DNA或RNA，无需复杂的热循环过程。尽管在一定程度上有效，但这些方法常常受到非特异性扩增、复杂的设计要求和反应机制的困扰，促使人们探索性能更优的替代方法。基于等温扩增的circRNA检测方法应优先考虑灵敏度、用户友好性和成本效益。在这种背景下，杂交链反应（HCR）提供了一个有吸引力的替代方案，其特点是等温、无需酶且扩增速度快（Chu等人，2019年）。HCR依赖于两个或多个发夹DNA探针之间的级联杂交。引入特定触发分子后，HCR促进双链DNA（dsDNA）串联体的自主生长。这种形成线性dsDNA产物的能力使该反应在核酸信号增强应用中具有广泛用途。结合HCR的无酶扩增功能和CRISPR/Cas系统的卓越特异性，HCR和CRISPR/Cas系统成为一种有前景的策略。研究表明，这种组合方法对于识别多种目标（包括细胞外囊泡、miRNA-21和沙门氏菌）有效（Xing等人，2020年；Long等人，2024年；Qiao等人，2023年）。
在本研究中，我们通过集成一种高度特异性的趾扣依赖型捕获探针-启动子链双链结构，增强了该检测系统，从而实现对circRNAs的精确识别。这种方法利用了趾扣介导的链置换的热力学优势，作为后续HCR和CRISPR-Cas12a扩增级联反应的强大启动器。特别是，高效的反应载体对于通过特定捕获探针实现目标分子的精确识别和富集至关重要。金属有机框架（MOFs）是通过金属离子/簇与有机配体的强键驱动自组装形成的多孔三维晶体材料（Furukawa等人，2013年；Zhou等人，2014年）。将功能化磁性纳米颗粒（MNPs）与MOFs结合制备磁性金属有机框架（MMOFs）在固液相分离和生物分子富集方面受到了更多关注，因为它们易于分散、孔隙率高、吸附能力强、超顺磁性和较大的表面积与体积比（Li等人，2023年；Zhou等人，2025年）。在此，我们开发了一种多功能磁性MOF复合体（Fe3O4-Au@UIO-66-NH2）作为趾扣探针的载体。氨基功能化的UiO-66（UiO-66-NH2）框架提供了高密度、生物相容的微环境，保护趾扣探针免受复杂生物基质中的核酸酶降解，并降低了趾扣介导的链置换的活化能。在Fe3O4@UIO-66-NH2上修饰的Au纳米颗粒（AuNPs）通过Au-S共价键提高趾扣探针的装载效率，同时稳定趾扣依赖型捕获探针，从而增强其分子识别能力和结构完整性。
最终，我们开发了一种基于Fe3O4-Au@UIO-66-NH2@趾扣探针介导的HCR和CRISPR-Cas12a系统的超灵敏检测circ_0051240的方法。鉴于当前circRNA检测的局限性和挑战，我们的方法不是简单的技术堆叠，而是一种基于组分之间内在生化关联和热力学一致性的合理架构设计。通过优化生物界面和分子识别动力学，我们建立了一种稳健的分析范式，其根本创新体现在以下几个方面：首先，设计了适应拓扑结构的磺化趾扣依赖型捕获探针-启动子链双链结构，以特异性识别circRNA的BSJ。所得circRNA-探针杂交体比初始双链具有更负的Gibbs自由能（ΔG），为有效的链置换提供了强大的热力学驱动力。该双链结构实现了精确高效的BSJ结合，同时最小化了与线性RNA的非特异性相互作用。其次，磺化趾扣-H0双链与Fe3O4-Au@UIO-66-NH2复合体的共价连接通过Au-S和Zr-O-P键确保了circRNA结合时启动子链（H0）的受控释放。这种独特架构促进了固液界面上的快速链置换反应，有效降低了BSJ特异性识别所需的活化能。此外，Fe3O4的整合不仅实现了快速磁富集，还使反应组分在受限的纳米空间内预浓缩。这种设计避免了自由趾扣探针系统中观察到的H0过早释放，显著减少了不必要的HCR启动产生的背景信号。第三，HCR系统被设计为生成具有最佳间距和高密度CRISPR识别基序的dsDNA串联体。这种基序排列最大化了CRISPR-Cas12a的转切割活性，促进了Cas12a-sgRNA复合体与dsDNA产物的有效结合，实现了协同扩增效应，超过了单独使用HCR和CRISPR-Cas12a系统的叠加效果。总体而言，本研究提出了一种创新的分析策略，利用界面工程指导MOF辅助CRISPR生物传感器的合理设计，适用于精准肿瘤学应用。
