Msx1基因编码一种同源框转录因子，它在发育中的组织和器官（包括外胚层、肢芽和颌原基）中调节多种模式形成事件，其脊椎动物同源物为Msx2（参见Davidson, 1995; Ramos and Robert, 2005的综述）。例如，在早期外胚层发育过程中，Msx1在非神经外胚层和神经板之间的神经边界处表达，在神经嵴的特异性形成中起关键作用（Tríbulo et al., 2003; Sakai et al., 2006; Ramos and Robert, 2005；另见补充图1）。此外，在颅面发育过程中，Msx1在下颌弓的神经嵴来源的外间充质、额鼻隆起和上颌突中表达（Tucker et al., 1998; Wakamatsu et al., 2019；参见McCollum and Sharpe, 2001的综述），从而参与颌部的近端-远端模式形成，并进一步影响不同牙齿类型的定位。
磨牙、前磨牙、犬齿和门牙沿着近端-远端轴在特定物种特有的位置和数量上发育，这些共同构成了牙齿排列模式（称为牙齿公式）。牙齿公式的变化是哺乳动物物种间生态形态特化和生态位划分的基础。先前的研究表明，每种牙齿类型的定位是由颌原基中外间充质中特定区域表达的同源框转录因子（包括Alx3、BarX1和Msx1）调控的（McCollum and Sharpe, 2001的综述）。Msx1的表达由颌原基远端上皮分泌的BMP4激活，而BarX1则由近端上皮分泌的FGF8诱导（Tucker et al., 1998）。我们之前的研究表明，不同哺乳动物物种中Msx1在颌原基中的调控方式存在差异，这有助于形成物种特异性的牙齿排列模式（Wakamatsu et al., 2019）。值得注意的是，在发育中的下颌弓中，Msx1的表达域较广，并且与负鼠和雪貂的近端BarX1表达域有显著重叠；而在小鼠中，Msx1的表达仅限于原基的远端，这与啮齿类特有的牙齿排列模式相关（Wakamatsu et al., 2019）。
为了全面阐明Msx1在颌原基中的表达调控机制，有必要识别控制其转录的顺式调控元件以及与其结合的转录因子。先前在转基因胚胎中研究小鼠Msx1启动子上游区域的研究已经鉴定出几个驱动Msx1在胚胎组织中表达的增强子，包括背侧神经管、肢芽和心脏神经嵴来源的组织（MacKenzie et al., 1997; Miller et al., 2007, 2008）。然而，目前尚不清楚是否存在其他增强子，以及多个调控元件的组合活动是否对发育中的颌原基中Msx1的表达模式有贡献。
比较序列保守性长期以来被用作识别顺式调控元件的策略，其中包括潜在的增强子。然而，人们也认识到顺式调控元件可能在进化过程中获得或丢失，从而可能导致谱系特异性的基因表达谱（Levine, 2010; Rebeiz and Tsiantis, 2017的综述）。此外，即使在保守的元件内部，序列修饰也可能导致表达模式的分化（例如，Cretekos et al., 2008; Koshikawa et al., 2015; Booker et al., 2016; Pham et al., 2017; Wakamatsu and Suzuki, 2019；另见Carroll, 2005; Levine, 2010; Rebeiz and Tsiantis, 2017的综述）。因此，仅靠序列保守性不足以完全解释基因调控的时空特异性，尤其是在感兴趣的物种内部或物种间驱动进化结果时。相反，直接识别开放染色质和活性增强子的方法（如ATAC-seq和表观遗传组蛋白修饰分析）被广泛用于这一目的，特别是在小鼠等模型生物中，因为这些生物有大量的公共数据集。然而，这些方法的一个主要局限性是缺乏关于所鉴定增强子调控哪些基因的信息。
下一代测序技术的最新进展使得研究基因表达的表观遗传调控和高阶染色质结构成为可能（例如，Cotney et al., 2012；参见Li, 2021的综述）。特别是基于染色体构象捕获（3C）的方法，如4C或Hi-C，可以识别启动子与其潜在调控元件之间的物理相互作用（de Wit and de Laat, 2017的综述）。现在认识到染色质拓扑结构是发育基因表达时空调控的关键因素（Furlong and Levine, 2018的综述）。此外，由基因组重排引起的染色质结构改变可能导致新的基因表达模式，无论是在进化（例如，Marlétaz et al., 2023）还是病理（例如，Franke et al., 2016）背景下。
为了更好地理解Msx1在颌部模式形成过程中的表达调控，我们利用环状染色体构象捕获后进行测序（4C-seq；Krijger et al., 2020）来识别与Msx1启动子空间相邻的基因组区域。虽然我们希望识别出在负鼠和小鼠中促进Msx1物种特异性空间表达的增强子，但目前尚无高效的方法可以在负鼠或其他有袋类胚胎中进行大规模增强子筛选。由于我们之前使用鸟类胚胎来检测增强子活性（例如，Wakamatsu and Suzuki, 2019），并且FGF和BMP信号通路在调节Msx1和BarX1等颌部模式形成基因中的作用已在鸡中得到充分研究（Barlow et al., 1999; Chen et al., 2000; Wakamatsu et al., 2019），因此我们选择鸡胚胎进行初步的4C-seq分析和随后的增强子筛选。通过4C-seq和比较基因组学结合鉴定的候选调控序列随后在鸡胚胎中进行了测试，以评估增强子活性。我们进一步比较了鸡和小鼠颌原基的基因组和4C-seq数据集，从而鉴定出与Msx1位点相关的先前未表征的调控元件。这些数据为不同脊椎动物分支中颌部模式形成的进化调控提供了新的见解。
Acemel et al.,; Devidson, 1995; Foerst-Potts and Sadler, 1997; International Chicken Genome Sequencing Consortium, 2004; Lettice et al., 2017; Ramos and Bobert, 2005; Wakamatsu,.
