引言
在禽类日粮中，随着低蛋白日粮的广泛应用，当膳食氨基酸不平衡时，支链氨基酸（BCAA）拮抗现象日益凸显。BCAA包括亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）。其中，丰富的Leu在拮抗中起主导作用，而Ile和Val的作用较温和，补充Val比Ile更能有效缓解过量膳食Leu的拮抗效应。为了充分挖掘低蛋白日粮的效益，理解BCAA拮抗机制并制定调控策略至关重要。胰岛素与BCAA分解代谢密切相关，但其与不同BCAA成员之间的具体功能关系尚存争议。本研究旨在利用Ile和Val的独特功能角色，探究其在Leu过量条件下缓解拮抗的具体机制，并证明这两种氨基酸通过调节胰岛素功能发挥这些作用。
材料与方法
本研究使用300只雄性爱拔益加（Arbor Acres）肉鸡进行实验。基于中国《鸡饲养标准》（2004）配制日粮，正常蛋白日粮粗蛋白水平在三个生长阶段分别为23%、21.5%和20%，低蛋白日粮在此基础上降低2%。实验在高Leu浓度条件下，将Val或Ile浓度上下调整15%，以研究拮抗反应机制。实验期从0到42天。在实验结束时，采集血液、肝脏和胰腺样本。测定血清BCAA、胰岛素、胰岛素样生长因子1、白细胞介素（IL）-6、葡萄糖等生化参数；测定肝脏中BCAA分解代谢关键酶[支链氨基转移酶（BCAT）和支链α-酮酸脱氢酶（BCKDH）]活性及脂肪含量；并对肝脏组织进行转录组学和脂质代谢组学分析。
结果
异亮氨酸和缬氨酸在肝脏代谢和胰岛素功能中发挥特定作用
与低蛋白对照组（LP）相比，补充缬氨酸（LPHV）或限制异亮氨酸（LPLI）能显著改善肉鸡的生长性能，表现为更高的最终体重和更低的料重比，表明调节日粮Val和Ile浓度可有效缓解BCAA拮抗。
补充Ile显著增加了胰腺指数，导致血清胰岛素和胰岛素样生长因子1水平升高，血糖水平降低，表明Ile可能促进胰腺发育和胰岛素分泌。相反，Val对胰腺指数影响甚微。尽管补充Val后血清胰岛素水平升高，但相应的血糖水平并未如预期下降，提示Val可能抑制正常的胰岛素功能。补充Ile和Val均显著增加了肝脏指数，提示两者对肝脏有负面影响。油红O染色显示，补充Val后肝脏红色脂滴显著增加，而限制Val则使其减少；相应的，补充Val后肝脏脂肪酸和低密度脂蛋白含量显著升高，高密度脂蛋白降低，而调整Ile则未引起显著变化。这表明Val可能通过肝脏脂肪积累诱导不良反应，而Ile对脂肪代谢影响甚小。肝脏苏木精-伊红染色显示，随着Ile水平增加，肝脏中炎症细胞逐渐积聚，并伴有明显的炎症细胞浸润和空泡化；同时，血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性显著增加，表明Ile可能通过促进肝脏炎症造成不利影响。
蛋白激酶B（AKT）/mTOR信号通路是Val和Ile诱导肝脏代谢变化的共同途径
转录组分析发现，调整Val和Ile水平分别导致了18个和15个共同的差异表达基因。在Val调整组中，差异表达基因的分子功能主要富集于寡腺苷酸合成酶和氨甲基转移酶活性相关的生物学过程，代谢途径主要涉及甘油酯代谢、甘油磷脂代谢以及mTOR信号通路。在Ile调整组中，差异表达基因的分子功能主要富集于嘌呤代谢相关过程，代谢途径主要涉及Wnt、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）和细胞因子信号通路。这些结果揭示了Val和Ile在转录水平上引起的肝脏代谢详细改变，与先前Val促进肝脏脂肪积累、Ile诱导肝脏炎症的发现一致。尽管Val和Ile调控的差异表达基因分布在不同的通路中，但它们都清晰地汇聚于AKT/mTOR信号通路。
缬氨酸促进神经酰胺积累并抑制胰岛素信号
脂质代谢组学分析显示，调整Val后，肝脏脂肪的四个组分——甘油三酯（TG）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和神经酰胺（Cer）——存在显著差异。补充Val后TG含量显著降低，提示Val可能通过改变脂质合成方向来调节脂质代谢。共鉴定出三个共同的差异脂质代谢物：Cer(d16:0_16:0)、PE(43:5)和TG(18:3_10:3_10:4)。构建的代谢机制图表明，补充Val后，脂质分子合成的前体棕榈酰辅酶A被重新导向Cer生成，抑制了TG的产生，最终增加了PE水平。整合脂质组学和转录组学分析，并经过qPCR验证，证实Val补充破坏了胰岛素信号中的PI3K/AKT轴，并显著改变了脂肪代谢相关转录因子的表达水平。此外，上游调节因子LAMB2和ITGA表达显著降低，表明Val可能通过直接影响和改变脂质代谢来抑制PI3K/AKT信号。受损的胰岛素信号与胰岛素抵抗密切相关。胰岛素抵抗的敏感标志物——酰基肉碱、抵抗素和纤溶酶原激活物抑制剂-1的肝脏水平在Val补充后均升高，证实了该条件下胰岛素抵抗的发生。胰岛素受体分析显示受体功能无变化，表明观察到的抵抗并非受体介导。总之，Val通过特异性积累肝脏脂质（尤其是Cer）诱导胰岛素抵抗，从而抑制胰岛素信号通路。
异亮氨酸通过释放IL-6促进胰岛素分泌
qPCR验证证实，Ile补充显著上调了AKT/mTOR表达，并激活了下游NF-κB炎症信号通路。对炎症反应表型及相关代谢物的检查发现，γ-谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶活性的变化再次证实了肝脏炎症的发生。在三种炎症细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）中，只有IL-6水平发生改变，强调了IL-6释放在Ile诱导的促炎效应中的特异性。鉴于炎症因子与胰岛素分泌相关的报道，研究聚焦于IL-6，发现在血液和胰腺组织中IL-6水平的变化支持了这一假设，表明IL-6从肝脏释放并通过血液运输至胰腺。对胰腺主要激素的分析显示，胰高血糖素、胰岛素及其分泌前体胰高血糖素样肽-1（GLP-1）之间的平衡发生了显著改变。mRNA表达分析证实，IL-6通过抑制PC2表达和胰高血糖素产生（而不改变胰高血糖素原水平），从而增强胰高血糖素原向GLP-1的转化，进而促进胰岛素分泌。
讨论
本研究表明，调节低蛋白日粮中不同BCAA的水平可以缓解BCAA拮抗，这提示不同支链氨基酸之间存在显著的功能和代谢差异，并且存在一种区分三种氨基酸分解代谢潜能的BCAA及其分解酶的中间因子。胰岛素被选作研究BCAA拮抗的中间介质具有科学依据，因为它能促进BCAA的氧化和分解代谢。
先前研究认为Val补充比Ile更能缓解拮抗，但本研究证明限制Ile也是解决拮抗的有效策略。这些发现凸显了Ile和Val在胰岛素功能中的相反作用。Ile作为Leu的异构体，在改善胰岛素功能方面具有与Leu相当的效果。相反，Val对胰岛素功能的有益作用鲜有报道，而其有害作用已被广泛记录。
BCAA，特别是Leu，与mTOR信号的激活密切相关。在本研究中，通过肝脏转录组分析观察到了由过量Ile和Val引起的肝脏转录水平变化。Val通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路破坏胰岛素信号。脂质组学分析进一步揭示，Val通过调节脂质代谢，特别是破坏胰岛素信号通路来诱导胰岛素抵抗。在Val的影响下，TG含量下降，突出了Val在改变脂质合成中的作用。尽管TG与胰岛素抵抗的关系已被逐渐解耦，但其他脂质代谢物可能导致胰岛素抵抗。本研究表明，Val促进了Cer的积累，而Cer已被证明会阻碍胰岛素信号并抑制葡萄糖的摄取和储存。
据报道，Ile通过Wnt信号激活mTOR及其下游的NF-κB炎症通路，从而诱导肝脏炎症。FZD和Axin是Wnt信号通路的关键组分，它们的显著表达表明Ile通过促进该通路内转录因子之间的相互作用来激活和传播Wnt通路。虽然BCAA被广泛认为与mTOR激活直接相关，但本研究结果表明，Ile的促进作用更集中于上游的Wnt信号通路。NF-κB是经典的促炎信号通路，调节白细胞介素和肿瘤坏死因子的释放。Ile的促炎作用并非通过经典的NF-κB信号发生，而是通过涉及IKKα介导的RelB/p52二聚体激活的替代机制，这可能解释了为何在三种典型的炎症细胞因子中只有IL-6被释放。IL-6在葡萄糖代谢中起着关键作用，血液IL-6水平可用于预测2型糖尿病的发病。本研究发现，IL-6通过促进激素原转化酶PC1/3的表达来增强GLP-1的释放，从而刺激胰岛素分泌。
结论
综上所述，Ile和Val通过影响胰岛素信号通路来调节BCAA拮抗。这一发现不仅为确保低蛋白日粮中充足的氨基酸营养提供了策略，也凸显了BCAA成员功能之间相互依赖与独立的复杂相互作用。
