微流控平台实现纤维蛋白渗透、溶解与细胞侵袭多参数分析

本文介绍的是一种创新的H型微流控芯片平台，它能够在同一个水凝胶中，对纤维蛋白（fibrin）的渗透性（permeability）、溶解动力学（fibrinolysis kinetics）、成纤维细胞（fibroblast）侵袭以及血栓（clot）扩展进行多重、实时的定量分析。该系统仅需约3 µL的凝胶体积，即可通过延时共聚焦显微镜捕获1.98×10−5到1.67×10−4cm2∙s−1范围的溶质渗透系数，最快达12分钟的溶解半衰期以及细胞迁移数据。通过系统改变纤维蛋白原（fibrinogen）浓度（1.5–10 mg∙mL−1）和凝血因子XIII（FXIII）交联密度，研究揭示了随着纤维蛋白原浓度增加，纤维蛋白的渗透性最大可相差3.7倍，溶解速率最大可改变9倍，而成纤维细胞渗透最多可被抑制64%。该平台基于标准的软光刻技术和常规显微镜工具，可以集成到现有的微生理系统（microphysiological systems）中，或作为抗凝剂（anticoagulants）、促愈合疗法（pro-healing therapies）以及患者特异性风险评估（patient-specific risk assessment）的高通量筛选工具。它架起了机理性纤维蛋白研究与转化生物材料（biomaterials）设计之间的桥梁，为精准血栓建模（precision thrombosis modelling）和再生医学（regenerative medicine）开辟了新途径。

1 引言

纤维蛋白在血液凝固中扮演着核心角色，它不仅是指导伤口修复的临时支架，也是血栓形成中的致病性基质。纤维蛋白原在患者个体间存在巨大差异，受遗传多态性、转录后修饰等多种因素影响，这使其在疾病研究和作为再生生物材料的应用面临挑战。传统研究方法需要大量样本和复杂设备，限制了研究效率和可重复性。微流体装置因其样本用量少、分析通量高而具有独特优势。本文旨在验证并应用一种微流控装置，用于评估纤维蛋白支架的渗透、溶解和成纤维细胞浸润，为理解纤维蛋白在止血、伤口愈合及病理条件下的复杂行为提供新工具。

2 结果与讨论

2.1 纤维蛋白凝胶在微流控装置中的多参数分析

本研究展示了一种H型通道微流控平台（）对纤维蛋白基质进行全面多参数分析的能力。通过将渗透性、溶解性、成纤维细胞浸润和血栓扩展等多个关键检测集成到一个装置中，该系统提供了一种在受控微观条件下探究纤维蛋白动态生物物理和生化特性的流线化方法。研究证实，增加纤维蛋白浓度会降低基质渗透性、增强对溶解的抵抗力并抑制三维成纤维细胞侵袭。对比成人纤维蛋白和胎儿纤维蛋白（fetal fibrin）的研究发现，以较低密度和较高唾液酸化（sialylation）为特征的胎儿纤维蛋白，允许更快的成纤维细胞浸润并显示出更高的渗透性（−1纤维蛋白凝胶的渗透共聚焦显微图。C显示，与成人纤维蛋白相比，胎儿纤维蛋白总体上更具渗透性，但这种差异仅在用FXIII制备的纤维蛋白中具有统计学显著性。">）。有趣的是，虽然凝血因子XIIIa（FXIIIa）交联对成人纤维蛋白影响不大，但它显著增加了胎儿纤维蛋白的溶解抵抗力，表明FXIII可能在稳定具有独特糖基化（glycosylation）特征的胎儿基质中发挥了更重要的作用。

2.2 作为纤维蛋白网络结构特征的渗透性表征

研究人员表征了不同浓度成人纤维蛋白的渗透性（），并比较了用或不用FXIII处理的成人和胎儿纤维蛋白的渗透性。增加纤维蛋白浓度会降低其对70 kDa葡聚糖染料的渗透性，从1.5 mg∙mL⁻¹纤维蛋白的7.35×10⁻⁵cm²∙s⁻¹降至5和10 mg∙mL⁻¹时的2.60×10⁻⁵cm²∙s⁻¹和1.98×10⁻⁵cm²∙s⁻¹。FXIII略微降低了成人纤维蛋白凝块的表现渗透性，但差异无统计学显著性。相比之下，用FXIII制备的胎儿纤维蛋白对470 Da罗丹明B的渗透性（1.46×10⁻⁵cm²∙s⁻¹）显著高于成人纤维蛋白。高倍共聚焦图像表明，胎儿纤维蛋白聚合形成的纤维网络密度低于成人纤维蛋白。在本实验条件下，FXIII交联并未对成人或胎儿纤维蛋白的溶质渗透性产生统计学上的显著改变。

2.3 纤维蛋白溶解动力学与FXIII在基质稳定中的作用

在微流控装置中，研究人员以类似于渗透实验的方式评估了纤维蛋白溶解，通过共聚焦显微镜监测荧光信号的变化（，−1纤维蛋白凝胶的共聚焦显微图。C显示，胎儿纤维蛋白的溶解速度远快于成人纤维蛋白，用FXIII制备提供了一定的保护作用。">）。正如预期的那样，成人样品中纤维蛋白溶解的速率随着纤维蛋白浓度的增加而降低。用FXIII制备成人纤维蛋白并未显著降低溶解速率。然而，FXIII确实对胎儿纤维蛋白起到了保护作用，否则胎儿纤维蛋白会表现出最快的溶解速度。溶解速率与渗透性呈现相反的趋势：渗透性更高的纤维蛋白溶解速度也更快。成人与胎儿纤维蛋白的比较也显示出这种相反的关系，渗透性的相对顺序与溶解速率的相对顺序相反。

研究表明，FXIII可以直接提高胎儿纤维蛋白的溶解抵抗力，这为关于FXIII和溶解抵抗力的争议性话题增添了新内容。在生理环境下，全血和血浆会产生更高的剪切应力和更广泛的分子拥挤（macromolecular crowding, MMC），产生更致密、更紧凑的纤维蛋白结构。本研究结果表明，FXIII交联通过轻微降低纤维蛋白渗透性来限制溶解剂的渗透，从而有助于进一步压实纤维蛋白。

2.4 成纤维细胞浸润与FXIII介导的成人和胎儿纤维蛋白调控

胎儿纤维蛋白被认为与新生儿表现出的加速伤口愈合有关。为了展示微装置在分析成纤维细胞浸润到纤维蛋白中的应用，研究人员在流动通道中接种成纤维细胞，并在7天内监测它们对相邻成人纤维蛋白凝胶的浸润情况（−1纤维蛋白相比，5 mg∙mL⁻¹纤维蛋白限制了浸润。">）。与渗透和溶解实验一样，5 mg∙mL⁻¹纤维蛋白比1.5 mg∙mL⁻¹纤维蛋白更限制浸润。值得注意的是，10 mg∙mL⁻¹纤维蛋白支持的总浸润面积与1.5 mg∙mL⁻¹相似，但浸润行为不同。在1.5 mg∙mL⁻¹纤维蛋白中，成纤维细胞主要保持三维形态并达到最大浸润深度；而在5和10 mg∙mL⁻¹纤维蛋白中，细胞迁移可忽略不计，并表现出由表面水平纤维蛋白溶解（fibrinolysis）促进的局部二维浸润。

为了评估成纤维细胞在用或不用FXIII处理的成人和胎儿纤维蛋白中的浸润趋势，研究人员在流动通道中接种成纤维细胞，并在5天内监测它们对相邻纤维蛋白凝胶的浸润（−1纤维蛋白凝块的共聚焦显微图。D显示，到第5天，胎儿纤维蛋白允许的HDFn浸润面积显著大于成人纤维蛋白。">）。共聚焦显微图清楚地显示，成纤维细胞向胎儿纤维蛋白凝胶中的迁移更多。表征显示，用FXIII制备的胎儿纤维蛋白诱导了最高程度的细胞方向性，有更高比例的细胞核排列方向与纤维蛋白起始边缘垂直，与主要浸润方向平行。到第5天，胎儿纤维蛋白中的浸润面积显著大于用或不用FXIII制备的成人纤维蛋白。

2.5 血栓沿纤维蛋白界面扩展的微流控建模

最后一个演示实验包括在全血中掺入Alexa Fluor 564标记的纤维蛋白原，并将其灌注到用Alexa Fluor 488标记纤维蛋白原形成的纤维蛋白凝块旁边。共聚焦显微图证实，通过添加氯化钙使柠檬酸化血液再钙化，允许纤维蛋白在柠檬酸化血液样本中更彻底地组装（）。到30分钟时，再钙化血液在纤维蛋白边界处产生的纤维蛋白荧光为1.57±0.669 A.U.，而未再钙化血液产生的纤维蛋白荧光为0.705±0.046 A.U.。

3 结论

本研究开发了一种多功能、易于制造的微流控装置，能够在单一标准化平台内对纤维蛋白基质的渗透性、溶解性、成纤维细胞浸润和血栓生长进行多参数分析。通过将该系统应用于比较成人和胎儿纤维蛋白，研究证实并扩展了先前的发现，即胎儿纤维蛋白表现出更高的渗透性、更快的溶解速度以及对成纤维细胞浸润更强的易感性，反映了一种更不稳定且更具再生能力的基质表型。研究结果也为凝血因子XIII的作用提供了新的见解，表明虽然FXIIIa交联对成人纤维蛋白特性影响有限，但它可能显著影响胎儿凝块的溶解抵抗力。该微流控检测方法相比传统的体相方法具有多个优势：样本用量少、分辨率高、与标准显微镜兼容，并且适用于并行多个纤维蛋白参数的实时定量分析。这些特性使其特别适用于生物材料研究、溶栓药物测试以及凝血力学和重塑的发育性或患者特异性研究。

4 实验部分

4.1 试剂制备与纤维蛋白原纯化

成人纤维蛋白原（FIB3）购自Enzyme Research Laboratories。胎儿（脐带）纤维蛋白原从脐带血浆中纯化获得。FXIII作为酶原（zymogen）购买。纤维蛋白凝胶用0或20 µg∙mL⁻¹的FXIII处理。

4.2 微流控装置制造

微流控模具使用CADworks3D打印机打印，并用聚对二甲苯C（parylene C）涂层。聚二甲基硅氧烷（PDMS）以10:1（w/w）的比例混合，浇铸到模具上，固化后剥离。PDMS微通道经等离子体处理与玻璃盖玻片或载玻片键合，形成微流控装置。

4.3 细胞培养与微流控装置中迁移的共聚焦监测

为提高纤维蛋白在PDMS和玻璃上的附着性，用聚-D-赖氨酸（poly-D-lysine, PDL）处理装置通道。将人真皮成纤维细胞（HDFn）用CellTracker Red CMTPX染色后，以高密度接种到流动通道。细胞在1、3、5和/或7天时在共聚焦显微镜下成像。实验结束后，细胞被固定并用鬼笔环肽（phalloidin）和DAPI染色以观察肌动蛋白和细胞核。

4.4 微流控装置中渗透和溶解的共聚焦监测

纤维蛋白凝块在不同成人纤维蛋白原浓度或1.5 mg∙mL⁻¹胎儿纤维蛋白原下制备，其中包含Alexa Fluor 488标记的纤维蛋白原。在渗透实验中，将罗丹明B或Texas Red葡聚糖染料以10 µL∙min⁻¹的流速灌注到流动通道中，通过共聚焦显微镜监测染料渗入纤维蛋白凝胶的情况。通过测量荧光强度随时间的变化来计算渗透系数。在溶解实验中，将纤溶酶（plasmin）灌注到流动通道中，监测纤维蛋白凝胶荧光信号或面积的减少。

4.5 全血凝块生长的共聚焦监测

将掺有Alexa Fluor 546标记纤维蛋白原和0.0或0.01 M CaCl₂的马全血灌注到预聚合的纤维蛋白凝块（用Alexa Fluor 488标记）旁边。以10 µL∙min⁻¹的流速灌注，并利用共聚焦显微镜在30分钟内监测凝块生长。

4.6 基于吸光度的纤维蛋白聚合和外源性溶解分析

使用酶标仪在350 nm波长下监测纤维蛋白凝块在凝血酶诱导下的聚合吸光度变化。聚合完成后，添加纤溶酶以监测溶解过程中吸光度的下降。

4.7 纤维蛋白网络结构的高倍共聚焦成像

将纤维蛋白凝块制备在载玻片和盖玻片之间，使用63倍水浸物镜获取高分辨率共聚焦z-stack图像。通过图像处理软件将图像二值化，计算纤维像素所占面积百分比，以评估纤维网络密度。

4.8 纤维蛋白交联程度的估算：SDS-PAGE光密度分析

通过SDS-PAGE和凝胶光密度扫描，分析纤维蛋白凝块在不同时间点（5、60、120分钟）的γ链单体与二聚体条带，以估算FXIII介导的交联程度。

4.9 统计分析

数据使用GraphPad Prism 9进行绘图和分析。定量数据通常以平均值±标准差表示。使用适当的统计检验（如Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析、Kruskal-Wallis检验、双因素方差分析）进行组间比较。显著性水平设定为α=0.05。