Triptonide（TN）是一种具有显著抗肿瘤[1]、免疫抑制[3]、抗炎[5]活性的二萜天然产物，来源于传统药用植物Tripterygium wilfordii。其独特的三环氧化物结构是其药理活性的关键功能基团[7]、[8]、[9]。然而，传统的植物提取方法受产量低、成本高和环境压力的限制，难以满足临床需求[10]、[11]。化学合成可以实现结构修饰，但过程繁琐且难以控制区域选择性[12]、[13]。相比之下，基于合成生物学的微生物异源合成策略具有绿色可持续性和可扩展性等优势，成为天然产物生产的重要方向[14]、[15]。然而，TN 生物合成途径中关键氧化步骤的酶促机制尚未完全阐明，这限制了高效细胞工厂的发展。
细胞色素P450在萜类骨架的后期修饰中起着核心作用。最新研究表明，CYP82D213是TN生物合成中的关键酶，负责催化前体化合物三萜酚酯在C7-C8、C9-C11和C12-C13位置的环氧化反应[16]。环氧化的区域选择性直接决定了产物的活性和毒性[8]，但CYP82D213如何精确控制氧原子的插入位置仍不清楚，特别是哪些氨基酸残基决定了其区域选择性。这些不确定性阻碍了对其催化效率和特异性的合理设计优化。
理解和控制P450酶的区域选择性是合成生物学和酶工程的基础。阐明其催化机制对于重建微生物中的功能性生物合成途径至关重要，最终有助于指导这些酶在工业应用中的合理设计。在本研究中，我们对CYP82D213作为TN生物合成中的三环氧化酶进行了功能表征，并通过多方面的工程改造解决了其催化效率低的问题。我们首先在烟草和酵母中验证了其活性，然后系统地对其活性位点、功能基序和表面残基进行了工程改造。我们确定了底物结合的关键结构决定因素，并提出了一个动态催化机制。通过结合有益突变，获得了性能大幅提升的突变体CYP82D213H425Q/L459M/T365R，为TN及相关生物活性二萜的高效微生物生产奠定了基础。
