新型抗p16抗体片段-药物偶联物的开发及体外抗肿瘤效应评估

时间：2026年2月16日

来源：International Immunopharmacology

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本研究开发了一种新型p16靶向抗体片段-药物偶联物（AFDC），通过人源化scFv结合细胞穿透肽（CPP S4₁₃）实现高效胞内递送阿霉素。实验证实AFDC对p16高表达细胞（HeLa、BT-549）具有显著选择性毒性，其机制依赖于p16介导的内吞作用，并在p16阳性三阴性乳腺癌类器官模型中有效抑制细胞存活，为靶向p16治疗提供了新策略。

广东药科大学生命科学与生物制药学院，中国广东省广州市

摘要

细胞周期调控因子p16在多种癌症中过度表达，其表达水平升高通常与肿瘤的侵袭性行为和不良预后相关。然而，直接针对p16的治疗药物的开发仍然面临挑战。抗体药物偶联物（ADCs）是一种成熟的靶向药物递送方式。为了探索能够克服传统ADCs固有缺陷的替代方案——例如由于体积较大而导致的肿瘤穿透性有限，以及Fc结构域可能引发的免疫原性风险——我们设计了一种新型的p16靶向抗体片段-药物偶联物（AFDC）。该偶联物由人源化单链可变片段（scFv）与能够穿透细胞膜的肽段融合而成，旨在通过p16介导的靶向作用高效地将细胞毒性载荷多柔比星递送到细胞内部。

我们从杂交瘤细胞中分离出五种独特的p16特异性scFv。经过人源化处理后，每种scFv都与细胞穿透肽段S4₁₃融合，生成scFv-p16-S4₁₃变体。经过亲和力评估后，选择scFv-p16-S4₁₃-04作为基础骨架，并通过化学接头与多柔比星偶联，从而制备出AFDC。在细胞实验中，这种AFDC表现出对p16高表达肿瘤细胞（HeLa, BT-549）的更强细胞毒性，而对p16低表达细胞（MDA-MB-231, LO2, HEK-293 T）的毒性较弱。这种选择性活性与靶标依赖性的内化过程相关。此外，在p16阳性的三阴性乳腺癌（TNBC）类器官模型中，AFDC处理显著降低了细胞活力，体现了其强大的抗肿瘤效果。

总体而言，这项概念验证研究支持了p16靶向AFDC对p16高表达肿瘤的治疗潜力，并展示了AFDC平台作为靶向细胞内蛋白的新策略的可行性。

引言

癌症继续对全球健康构成重大威胁，大约五分之一的人在其一生中会受到影响[1]。在女性中，乳腺癌和宫颈癌是最常见的恶性肿瘤，这两种癌症都表现出显著的生物学异质性，这使得有效治疗变得复杂[2]、[3]。尽管手术切除和放疗仍是当前治疗方案的基石，但其临床益处常常被不良反应和总体生存率的提升有限所抵消。靶向治疗和免疫疗法的出现通过更精确地调节肿瘤生物学特性，彻底改变了癌症管理方式[4]、[5]。然而，可作用靶标的范围狭窄限制了这些先进疗法的应用范围，因此迫切需要寻找新的分子靶点来优化和扩大这些疗法的影响。

周期依赖性激酶抑制剂p16（p16^INK4A）是细胞周期的关键调控因子，在包括宫颈癌和乳腺癌在内的多种癌症中过度表达[6]。值得注意的是，p16在HPV诱导的宫颈癌和三阴性乳腺癌（TNBC）中经常上调，其表达水平与更侵袭性的肿瘤行为和较差的预后相关[7]、[8]。p16在恶性肿瘤中的这种一致过表达模式表明它具有作为诊断生物标志物和治疗靶点的潜力。基于这一观察，我们假设靶向p16可能为选择性治疗高p16表达肿瘤提供一种新方法。为了探究这一潜力，我们专注于开发一种专门针对p16的抗体片段-药物偶联物（AFDC）。这种方法旨在评估p16靶向治疗是否能够选择性治疗高p16表达的肿瘤，并评估将AFDC作为这些恶性肿瘤治疗策略的可行性。

抗体药物偶联物（ADCs）通过结合单克隆抗体的特异性和载荷的细胞毒性，实现了对肿瘤细胞的靶向递送[9]。然而，尽管已有几种ADC获得批准，但由于肿瘤穿透性差和大型抗体分子在体内的长期暴露等问题，治疗实体瘤仍然具有挑战性[10]。为了解决这些问题，我们使用单链可变片段（scFvs）代替全长抗体来构建AFDC。scFv是最小的能够结合抗原的功能单位[14]。与全长抗体相比，scFvs具有多个优势，包括更好的组织穿透性、降低的免疫原性，以及在原核和真核系统中的高效生产[15]、[16]。由于其紧凑的结构和与人类抗体的高序列同源性，scFvs非常适合人源化，是靶向治疗的理想平台。例如，基于scFv的疗法如blinatumomab（Blincyto®）和针对CD19的CAR-T疗法在治疗B细胞恶性肿瘤方面表现出显著疗效[17]、[18]、[19]。尽管取得了这些成功，但针对p16的scFv用于治疗的应用尚未开发出来，尽管该蛋白在TNBC和宫颈癌等关键癌症中过度表达。基于scFv的这些优势，我们旨在构建一种能够在p16高表达细胞内选择性递送和浓缩载荷的AFDC。

在这项研究中，我们开发了一种新型的p16靶向scFv用于AFDC。我们首先从杂交瘤细胞中分离出抗p16抗体的可变区域，然后将重链和轻链的可变区域通过柔性（G₄S）₃接头连接起来，构建scFv基因。随后将细胞穿透肽段S4₁₃序列融合到该基因中，生成重组scFv-p16-S4₁₃。将所得融合基因克隆到pET-28a(+)载体中，在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达。成功表达后，通过ELISA和Western blot方法纯化了scFv-p16-S4₁₃，并测定了其结合亲和力和特异性。选定的scFv-p16-S4₁₃通过胺-醛缩合反应与多柔比星（DOX）偶联，形成AFDC，并通过UV–Vis光谱法测定了药物与抗体的比例（DAR）。为了评估p16靶向AFDC的体外抗肿瘤活性和选择性，我们在p16高表达（HeLa, BT-549）和p16低表达（MDA-MB-231）肿瘤细胞系以及正常人类细胞（LO2和HEK-293 T）上进行了细胞毒性实验、免疫荧光成像和逆转录定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）分析。此外，还使用p16阳性的TNBC类器官模型进一步评估了AFDC的抗癌效果，包括ATP含量测定和凋亡相关通路的基因表达分析。我们希望AFDC能为TNBC的治疗提供新的思路。

试剂、材料和仪器

关键试剂来源：PrimeScript™ 1st Strand cDNA合成试剂盒、pMD™18-T载体克隆试剂盒和2 × PrimeSTAR® MAX DNA聚合酶（Takara Bio，中国大连）；UE PCR清洁试剂盒（UELandy Biotech，中国苏州）；Cell Counting-Lite 3D荧光细胞活力测定试剂（Vazyme Biotech，中国南京）；5 × RT SuperMix和2 × SYBR Green qPCR Master Mix（APExBIO，美国休斯顿）；Dextran T-10和盐酸多柔比星（DOX）（Solarbio，中国北京）；p16单克隆抗体

p16基因的扩增与分析

为了获取p16基因，本研究选择了五个先前筛选过的杂交瘤细胞系进行可变区域测序。使用Trizol方法提取总RNA，并通过核酸电泳（图2A）验证其完整性，结果显示28S、18S和5S rRNA条带完整。NanoDrop光谱法确认了RNA的纯度，A260/A280比值在1.8到2.0之间。随后进行逆转录生成cDNA

讨论

靶向治疗继续成为肿瘤治疗的基石。肿瘤抑制因子p16由于其在多种恶性肿瘤中的频繁过表达而成为一个有吸引力的治疗靶点[7]、[8]。ADCs确立了靶向载荷递送的范式。为了探索能够克服传统IgG基ADCs固有缺陷的策略——包括由于体积较大而导致的组织穿透性受限，以及Fc结构域的免疫原性[43]——我们

结论

总之，本研究成功开发了一种新型的p16靶向AFDC，并在细胞水平和TNBC类器官中展示了其强大的抗肿瘤效果。我们的结果表明，AFDC能够选择性靶向p16，对p16高表达的肿瘤细胞和TNBC类器官表现出显著的细胞毒性。这些发现证明了AFDC对p16阳性TNBC的治疗潜力，为p16靶向治疗提供了初步的实验依据。

伦理声明

本研究中使用患者来源的乳腺癌类器官已获得皖南医学院第一附属医院伦理委员会的批准（批准编号：(2025) LunShenYan No. 39）。所有参与研究的参与者均签署了知情同意书。

作者贡献声明

Hui He：撰写——初稿、可视化、验证、方法学设计、实验研究、数据整理。Xiaoling Chen：撰写——初稿、可视化、验证、实验研究、数据整理。Yueqiu Chen：撰写——审稿与编辑、实验研究、数据分析。Qingpeng Li：实验研究、数据分析。Fan Yang：项目监督、概念构思。Lin Zhou：资源协调、项目管理、资金争取、概念构思。