1. 引言
蛋白水解物因其潜在的健康促进特性、在可持续循环经济中的作用以及最大化利用食品生产副产物的潜力而日益受到欢迎。它们通常通过酶法蛋白水解（EPH）产生，是含有数千种不同长度和序列的肽的复杂混合物。家禽是全球消费量最大、单位蛋白质二氧化碳当量最可持续的肉类之一，其副产物可用于生产富含蛋白的水解物。这些水解物已被证明具有血管紧张素1转换酶（ACE-1）和二肽基肽酶4（DPP4）抑制活性，这是调控血压和血糖的两个治疗靶点。
家禽蛋白水解物含有相当比例的胶原蛋白。胶原蛋白具有特征性的三螺旋结构，其α链含有甘氨酸（Gly）-X-Y重复单元，其中X和Y位点通常分别被脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyp）占据。由于Hyp是一种几乎为胶原蛋白所特有的修饰氨基酸，它被认为是测定胶原蛋白含量的合适生物标志物。脯氨酸的羟基化水平在不同来源的胶原蛋白中有所不同，胶原三螺旋的熔解温度（即其结构稳定性）与Hyp含量成正比。例如，对于家禽，通常基于温血动物胶原蛋白含有13.5%（w/w%）Hyp的假设来计算胶原蛋白含量。
Hyp含量是家禽水解产物的一个关键属性，它决定了从潜在生物活性到功能特性等一系列参数。根据欧盟委员会（EC）第152/2009号法规，总氨基酸组成需要通过24小时的酸水解、中和、离子交换色谱分离、茚三酮反应和光度检测来确定。这些分析既繁琐又耗时，通常由经过认证的实验室进行以节约成本。值得注意的是，定量需要每种分析物的校准标准品，根据商业分析实验室的报告，不同氨基酸之间的误差各不相同，对于Hyp通常约为20%。更快捷的选择是一种专为Hyp开发的比色法，该方法可在5小时内完成，但需要昂贵的试剂，并且根据操作员和材料背景信号的不同，不确定性在10%到50%之间。
最近，光谱学方法已被研究用于胶原蛋白分析。例如，有研究使用干膜傅里叶变换红外（FTIR）光谱和多元校准模型（特别是基于层次聚类的偏最小二乘回归，HC-PLS）来基于Pro和Hyp引起的酰胺带振动定量胶原蛋白。当这些残基被纳入多肽链时，不同的FTIR光谱模式允许主要基于Pro和Hyp的叔酰胺振动进行相对定量。该方法提供了可接受的结果，但FTIR光谱的化学分辨率有限，因为它无法检测游离氨基酸。相反，核磁共振（NMR）在原子水平上提供结构信息，它本质上是定量的（qNMR），并且可以进行多目标分析。事实上，另一项研究在完全水解后使用qNMR，无需进一步样品制备，就在单次分析中定量了Hyp、Gly和丙氨酸（Ala）。该方法的一个缺点是需要高浓度（6 M）的氘代酸作为位移试剂以减少峰重叠，从而能够定量。正如预期，qNMR相比于其他方法具有显著优势。它表现出高重现性、特异性和准确性，符合定量1 H NMR（qHNMR）作为一种计量学方法的评级。
然而，在为家禽水解产物分析建立高精度qHNMR方法时，仍需解决几个挑战。首先，水解产物的物理化学性质被NMR捕获，但由于可变的盐含量（这需要对仪器进行仔细调整，即探头调谐和匹配），它偏离了经典qHNMR条件的建议。此外，峰重叠仍然是不确定性的主要来源，这是因为典型的1 H NMR谱图通常非常拥挤，这限制了通过积分（int-qHNMR）可达到的特异性。最后，高分子量（MW）分子会导致基线不完美。这些高分子量分子来自不完全水解，并且由于其较短的T2 弛豫时间常数而产生宽共振峰。
为了应对EPH的qHNMR分析中的特异性和准确性挑战，本研究采用了基于量子力学（QM）的qHNMR谱图评估方法。该方法利用1 H迭代功能化自旋分析（HifSA），一种基于QM的计算自旋分析（QMSA），对1 H-qNMR谱图进行详细分析。该分析利用目标氨基酸的HifSA谱图作为定性和定量参考。HifSA涉及QM基础，并通过计算产生给定分子的真实自旋参数。这一概念在2013年通过经典全自旋分析（FSA）概念的演变而确立。HifSA同时捕获1 H NMR谱的定性和定量属性。重要的是，HifSA能够解决峰重叠问题，并全面考虑所有高阶效应，这两点即使是超高场NMR谱图的解读也仍然面临挑战。已知1 H NMR谱在代谢组学分析中的效用预示着它们在复杂混合物（如EPH）分析中将有更广泛的应用。此外，从经济角度来看，qNMR分析作为一种替代方法越来越被接受，这得益于高通量仪器和日益强大的无液氦台式仪器能力。
本研究调查了酸对1 H NMR谱图的影响，并比较了通过经典积分与QM辅助量化获得的定量结果。研究目标不仅是克服经典int-qHNMR的局限性，而且还要减少样品制备需求，并简化与其他方法（如FTIR光谱）相比的校准过程。新的家禽水解物胶原蛋白qHNMR方法也得到了验证。总体而言，本研究旨在建立一种易于使用、快速、特异性和准确性均优于先前方法的qHNMR方法，为通过qHNMR更广泛地实施EPH氨基酸分析奠定基础。
2. 材料与方法
2.1. 原材料与化学品
使用了羟脯氨酸、二甲基砜、氘代盐酸、氘代水等化学品。火鸡水解物样品选自先前发表的研究，包括两个低胶原蛋白含量的样品（作为空白，TC_A， TC_B）和三个中高胶原蛋白含量的水解物（TC_C， TC_D， TC_E）。
2.2. 样品制备
制备了三种类型的样品：一组用于溶剂研究的已知浓度的Hyp溶液；一组用于方法验证的只含Hyp和Gly的参考分析物；一个含水解物背景的空白样品；以及几个添加了已知量Hyp的分析物样品。
• 溶剂研究：制备了七种不同离子强度的Hyp溶液，酸浓度范围为0.00至6.0 M DCl。
• 水解物样品：将冻干的水解物粉末溶解在1.0 M HCl中，然后在6.0 M HCl中于110 °C水解24小时，干燥后复溶于0.61 M DCl中，过滤至NMR管。
• 方法验证：包括回收率、线性、精密度、稳定性和重复性评估。
2.3. NMR仪器
在400 MHz Bruker NMR谱仪上进行测量，使用5 mm宽带探头，温度保持在25 °C。
2.4. 反转恢复实验（T1 ）
使用反转恢复脉冲序列测定所有氢的自旋-晶格弛豫时间常数T1 。
2.5. qHNMR实验
仪器通过氘通道锁场，匀场后记录qHNMR谱图。使用优化的90°脉冲，采集参数确保脉冲重复时间至少为所有感兴趣信号T1 的5倍。采集后，使用TopSpin和MestReNova软件处理谱图，并进行相位、基线校正和参考。积分在±0.03 ppm（±10 Hz）范围内进行。部分谱图进一步在MestReNova中进行处理，并导出用于在Cosmic Truth（CT）软件中进行HifSA分析。
2.6. 定量
比较了两种定量方法：使用TopSpin软件的经典积分法，以及使用CT计算谱图的基于QM的方法。在QM方法中，定量测量值来自通过HifSA在CT中迭代拟合的自旋系统的布居数。所有处理的qHNMR谱图均使用TopSpin的ERETIC2模块进行分析，浓度根据公式自动计算。一部分谱图也通过CT软件处理，生成的HifSA谱图布居数用于定量。
3. 结果与讨论
3.1. 不同溶剂酸度的影响
与纯分析物溶液不同，蛋白水解物需要完全的酸水解才能从肽和蛋白质片段中释放出组成氨基酸（如Hyp）。因此，了解不同酸性条件对NMR谱图以及Hyp定量的影响至关重要。使用含有13.0 mM Hyp的溶液评估了不同离子强度对qHNMR谱图的影响，这些溶液模拟了EPH样品，用于研究酸浓度对qHNMR谱图、溶液的NMR相关理化性质、仪器行为以及定量影响。
化学位移值受各种酸浓度影响，因为分子在溶液中的pKa 导致pH敏感官能团的质子化状态影响所有邻近原子的屏蔽和去屏蔽状态。观察到谱图中所有共振峰均发生统一的去屏蔽效应，所有峰型都向低场移动。虽然大多数质子的化学位移变化仅为0.1-0.2 ppm，但质子H-2的变化为0.4 ppm，这是由于氨基和羧基的质子化所致。谱图中受影响最大的峰是残留的HDO峰，其总位移达2.350 ppm。实际上，HDO与DSS参考峰之间的距离是pH的直接量度。溶液中的离子浓度与其化学位移的变化呈线性相关。这可以解释为由于水合氢离子的产生导致每个1 H核的电子比例减少，从而降低了磁屏蔽效应。
重要的是，虽然化学位移随酸浓度变化，但耦合常数（J）不受影响。通过HifSA获得的精确J值变化仅在0.02至0.30 Hz之间。考虑到这种变化远低于谱图的平均线宽，可以忽略不计。这共同证明了J耦合的恒定性质及其在不同溶剂离子强度下的高度一致性。正如其名，J耦合常数是真正恒定的，因此可用于明确识别分子。只要实验条件的变化不会改变分子的构象空间以至于影响J耦合，这一点就成立。相比之下，绝对化学位移（δ）需要接近相同的NMR条件才能用于此目的。
Hyp溶液的性质也受所用溶剂的影响。具体而言，随着酸浓度（水合氢离子）增加，质子表现出更短的T1 弛豫时间，这增加了分子间氢键的形成。相反，在高酸性样品中，部分辐射会耗散，增加了获得90°翻转角所需的P1 脉冲持续时间。考虑到这两种变化的幅度差异，由于较短的T1 ，在较高酸浓度下每个周期的总时间可以减少。
此外，酸以及溶液中离子的存在会导致表面张力增加，从而降低蒸发速率。虽然这不直接影响密封的样品管，但在进行浓度测定时是有用的，因为样品的组成更稳定。一方面，离子浓度防止蒸发。另一方面，溶液中的离子会导致谱线展宽。这也妨碍了探头的调谐和匹配，从而引起信号强度的偏差。
总结离子强度效应，可以得出结论：虽然酸可用于缩短T1 、减少总采集时间，并可用作位移试剂以移动谱图中感兴趣的峰并最小化峰重叠，但溶液的总离子强度高度影响NMR实验及其定量性质。这对于食品和EPH样品是相关的，因为加工动物副产物通常会产生来自骨骼的较高灰分含量，这应仔细考虑。由于灰分含量变化很大，这会影响这些材料通过qHNMR的定量分析和产品分析。
酸含量对qHNMR分析的影响。在0.00–6.0 M DCl范围内，所有测试的酸性溶液都制备了含有13.0 mM Hyp和1.62 mM DSS的样品。每个样品采集三张独立的1 H NMR谱图进行处理以实现统计分析。定量使用经典积分法和外部校准（EC），通过ERETIC2方法计算Hyp的所有质子峰和DSS。结果突出显示，当增加酸浓度时，Hyp含量在3σ内被高估，而仅使用D2 O时，则在1σ内被低估。总体而言，七种酸性溶液的比较显示，用于测定分析物浓度的所有峰型的回收率从0.00到6.0 M DCl呈增加趋势。这表明随着离子浓度增加，通过积分定量的准确性下降。
重要的是要考虑，只有D2 O中的H-4峰型和酸中的H-4和H-2峰型在否则过于拥挤的区域（水解物样品中的4.6–0.8 ppm）内是不重叠的，因此可被认为是合理的积分目标。此外，残留溶剂峰在D2 O中靠近这几个适合int-qHNMR的共振峰，导致积分干扰。使积分更可靠的唯一可行对策是增加酸度，导致HDO共振峰线性向低场位移。然而，只有DCl浓度 >1 M才能允许使用 >30 Hz的积分范围。由于单独的Hyp谱图不能被认为是过度拥挤的，这种方法仍然只适用于H-4和H-2的峰型，而不适用于观察到的Hyp的其他四个质子峰型。
总之，这凸显了qHNMR中积分的内在局限性：与重叠谱线和/或残留溶剂信号干扰的峰型，以及在此类复杂样品中与其他化合物谱峰完全重叠的峰型，显然会产生不利干扰，并基本上使积分无效。对于DSS，情况与Hyp不同，因为尽管存在29 Si卫星峰，DSS产生的是一个本质上的单峰，更容易积分。有趣的是，与Hyp类似，DSS的理论浓度在0.00–0.99 M DCl溶液中被低估在1σ内，而随着酸浓度增加，在1.5–6.0 M DCl溶液中被高估在2σ内。Hyp和DSS的准确性都随着离子浓度增加而下降，尽管对DSS来说不那么明显。
每种测试酸性溶液选择一张谱图，考虑到所有可用记录中最低的FWHM和LQF。这些谱图进一步用MNova处理，随后使用CT中的迭代QMSA过程创建HifSA谱图。在此过程中，调整NMR自旋参数以最小化实验谱图与计算谱图（残差）之间的局部均方根，直到它们在每个细节上都匹配。这种微调不仅涉及δ值和J耦合，还涉及线宽和弛豫响应因子，该因子根据每个自旋粒子的个体弛豫校正其强度，将具有最完全弛豫（最高强度）的自旋归一化为1。由于此参数与布居数完全相关，所有用于定量的自旋响应因子都设置为1并锁定，以消除这种相关性。在CT内基于布居数的Hyp定量表明，所有测试的溶剂都能返回在理论值1σ内的值，并且样品间的变化是随机的。这也证明，通过int-qHNMR获得的所有评估峰型的Hyp回收率呈现出的明显线性增加，是一种积分伪影，可以通过QM辅助的qHNMR工具（如CT）克服。
尽管如此，选择了0.61 M DCl条件用于进一步的方法验证。这种酸性条件在残留溶剂峰位移方面提供了最佳折衷，Hyp的int-qHNMR回收率为99.2%，并且具有最佳的探头调谐和匹配能力。最终目标是获得水解物样品定量数据，误差小于5%。
3.2. qHNMR方法验证
本部分研究评估了qHNMR方法的回收率、线性（包括测定LOQ和LOD）、精密度、重复性和稳定性。
回收率通过向低胶原蛋白含量的火鸡水解物样品TC_A中添加不同量的Hyp和Gly进行评估。定量使用ERETIC2对Hyp的H-4和H-2峰型面积以及Gly的可用单峰进行。Gly与Hyp一起被包括在内，因为它是胶原蛋白特征螺旋结构中重复单元所含的三种氨基酸之一，有助于其结构。更重要的是，纳入这个小的非手性氨基酸是为了将其定量与Hyp进行比较，因为它们的峰型和相对于水解物1 H NMR谱图的位置不同。含有2.01 mM DMSO2 和1.67 mM DSS的溶液用作外部校准物。
结果表明，加标在样品间是精确的，相对标准偏差在0.30%到2.28%之间。然而，回收率准确度在80.8%到93.7%之间，Gly的准确度始终高于Hyp。这表明，尽管Gly单峰位于过度拥挤区域的中间，但它比H-4/H-2多重峰对总Gly丰度更具选择性，后者的峰型属于两个磁不等价核，但重要的是，更靠近残留溶剂峰。正如预期，QM-qHNMR方法提高了准确度，加标回收率在83.4%到100.9%之间，低浓度加标的Hyp和Gly误差分别为10%和1%。值得注意的是，低加标的回收准确度平均比中、高加标在int-qHNMR和QM-qHNMR中分别高出10%和6%。这可能是移液器体积误差的结果，当分配较高浓度溶液时，这种误差的影响更大。
考虑到Hyp回收的相对误差，QM-qHNMR在中、高加标时产生的误差低于int-qHNMR，但在低加标时误差更高。int-qHNMR在低加标时表现出的这种明显优势可能反映了基线相关的积分偏差对低强度多重峰的影响。然而，尽管在中等和高加标时存在技术上的不精确，但Hyp的误差从未超过商业分析实验室使用HPLC报告的值20%。这些误差（HPLC和qHNMR）低于比色法报告的误差，后者受样品间背景变化、操作不精确性以及其他氨基酸的干扰影响。然而，尽管QM-qHNMR带来了改进，但Hyp的误差仍然为10%，并未像Gly那样降至1%。这可能是由于谱图中共振峰的位置不同及其性质不同所致。Gly产生一个高信噪比的单峰，在谱图相对不拥挤的区域中突出。相比之下，Hyp的峰型是多重峰，与面积相等的单峰相比具有较低的信噪比。此外，只有H-2/H-4在高度拥挤区域之外，H位于高度拥挤的背景下，所有其他Hyp峰型则完全被背景掩盖。未定义的背景对Hyp定量带来的挑战反映在与Gly定量的不确定性差异上；未来对底层峰型的指认可以改进迭代QM过程的准确性，从而提高Hyp定量。
通过向另一个低胶原蛋白水解物样品TC_B添加不同量的Hyp和Gly来评估线性，以覆盖两种氨基酸0.00–15.0 mM的范围。绘制绝对积分值对加标浓度的图，得到线，Hyp和Gly的R2 值分别为0.995和0.983。这一结果与NMR光谱固有的定量性质一致。根据公式计算LOQ和LOD值，Hyp分别为3.59和1.09 mM，Gly分别为6.56和1.99 mM。考虑到这些浓度下相应的信噪比，很明显，Hyp的信噪比远低于Gly。这种差异清楚地反映了H-4/H-2多重峰相比于Gly的H-α峰型的真实单峰性质以及它们各自与背景比较的光谱区域中更宽的强度分布。总的来说，用于LOQ的公式和用于LOD的公式是基于校准方法开发的，该方法典型用于色谱，其原理与NMR不同，其转化为信噪比（传统上更常用于qHNMR）反映了其起源。Gly并不比Hyp更不适合定量，如方法验证所示，但由于其单峰性质，其特异性较低，如QM-qHNMR所示。然而，扩展这一讨论超出了本研究的范围，并且信噪比值与qHNMR文献建议一致，建议足够的扫描次数以达到信噪比值。
int-qHNMR测量的精密度和重复性结果以RSD和误差百分比表示。在三个不同星期的三天内测试重复性，使用相同火鸡水解物材料TC_E的两个独立样品，Gly和DSS的RSD ≤1%。相比之下，当通过H-4/H-2定量时，Hyp的RSD仅为3.6%，当积分H多重峰时甚至更低，为7.9%。然而，由于各自峰型的性质，这种限制并非意外。虽然Gly和DSS都产生具有明确且窄范围的单峰，但Hyp多重峰的峰型覆盖范围更广。因此，由于较大的背景以及由于难以手动一致地校正偏差和斜率而导致的积分变化，此类多重峰的积分不确定性增加。当目标峰型位于具有增加底层背景的高度拥挤区域内时，经典积分尤其容易受到基线缺陷的影响，如H-3所观察到的。总而言之，这些因素再次强调了经典int-qHNMR的内在局限性。
使用六个同一天独立制备的TC_E样品分析样品间精密度，通常显示出比重复性测试中观察到的更低的RSD值，Gly除外。此外，结果表明，精密度变异的最大贡献并非来自样品称重或移液，而是来自谱图处理，特别是积分。确实，在光谱处理过程中引入的变异性构成了整体可达到精密度的重要部分，突显了分析此类复杂谱图所面临的挑战。
根据图中呈现的数据，可以得出结论，回收率再次约为Gly和Hyp H-4/H-2的80%，但DSS的回收率更高。这使DSS成为合适的内标和校准物，并证实了其在酸中的稳定性。
为了确认样品稳定性，在同一TC_E样品在多个时间点进行了分析。虽然RSD高于先前情况，但所有变化都在平均值的2σ内，除了9周时的Hyp H-4/H-2，其仍在3σ内。这可能是积分过程引起变异的结果，高误差贡献来自积分的偏差和斜率校正。与int-qHNMR相比，基于QM-qHNMR的稳定性数据显示出更高的一致性，Hyp值全部落在1σ内，尽管认识到40小时谱图的匀场伪影。Gly的QM-qHNMR稳定性值与int-qHNMR的值一致，这是由于其单峰性质的峰型被积分/QM拟合所致。
更仔细的分析揭示，当应用分辨率增强的光谱处理时，可以根据匀场质量对谱图进行分组，这解释了异常值。比较QM-qHNMR与int-qHNMR的RSD，Hyp分别为3.5%和6.4%，Gly分别为7.5%和5.8%。一方面，这突显了QMSA的稳健性，因为Hyp可以在统计基础上计算，这得益于可用的多个峰型。另一方面，这显示了在过度拥挤的区域分析单峰（如Gly）的弱点，在那里无法使用其他峰型来增加稳健性。然而，只要所研究的样品在2个月的测试期间没有发生任何可见的变化，就认为它们是稳定的。通过观察所有记录的测量值都在平均值的1-2σ范围内得到了证实。
最后，额外的数据分析揭示了HDO峰的化学位移（这是酸度的函数）与样品制备和样品分析之间的时间存在关系。在2个月内，HDO峰向低场移动了4.5 ppb。这种小的峰位移，根据图对应于最小的0.0006 pH差异，可能归因于溶剂蒸发，尽管样品管被盖紧并用封口膜密封。这被认为是样品稳定性考虑变量中的一个次要因素，但在长期储存样品时需要考虑。这一发现强调，与较简单的样品类型相比，重要的是在特定时间范围内分析水解物样品以允许比较，例如1周。背景使得即使是体积和离子种类的微小变化也成为变异性的原因，导致高达5%的一般误差。当追求高精度时，这种额外的不确定性来源是不希望出现的。
总体而言，本文提出的用于胶原蛋白氨基酸测定的int-和基于QM的qHNMR方法验证，为Riemer等人的先前发现增加了有价值的见解。目前的结果表明，qHNMR总体上具有足够的准确性、精密度和重现性，并且与HPLC或比色法等其他可用分析技术相比具有优势。因此，qHNMR不仅准备被采纳为一种强大的定量替代方法，还具有其他优点，例如同时提供关于样品结构完整性和可能变化的信息。其扩展到检测和定量多个目标的能力增加了qHNMR的吸引力，并使其优于目前使用的其他方法。
3.3. 不同qHNMR方法的比较
通过两种主要技术测定了火鸡水解物中Hyp的含量：由商业分析实验室进行的标准化HPLC分析，以及内部进行的qHNMR分析。对于qHNMR分析，使用了三种从NMR数据导出定量测量的不同方法：使用Bruker ERETIC2方法的积分和外部校准；使用电子表格手动计算的积分和内外组合校准；以及使用布居数作为测量值的基于QMSA/HifSA的分析。此项探索性比较的结果如图6所示。
令人惊讶的是，通过int-ECIC-qHNMR测定的Hyp量始终高于ERETIC2获得的值，尽管两种方法使用相同的积分值。对于TC_E和TC_D，Hyp量分别高出6.5%和6.0%，而对于TC_C则高出12%。这可以合理地归因于两个因素：ERETIC2算法应用 校 正 的 差 异
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