1. 引言
鸡传染性支气管炎病毒（IBV），作为冠状病毒科（Coronaviridae）Gammacoronavirus属的代表成员，是全球养禽业最重要的病原体之一。该病毒通过呼吸道在家禽群中快速传播，导致高发病率以及因生长迟缓、产蛋量下降和继发感染造成的巨大经济损失。IBV具有广泛的组织嗜性，主要靶向呼吸道，但也影响肾脏、生殖系统和胃肠道，从而导致复杂多样的病理结果。自1931年被首次描述以来，全球已报道了多种血清型和基因型，如4/91、B1648、Aust T、QX和TW等。在中国，主要流行的基因型包括GI-7、GI-13、GI-19、GI-22、GI-28和GVI-1。作为一种冠状病毒，IBV频繁发生突变、重组和插入事件，导致显著的抗原变异和不同毒株间交叉保护效果不佳。近年来，大量研究表明IBV的持续进化导致了全球范围内各种重组毒株的出现，即使在已接种疫苗的鸡群中也不例外。这些遗传动态与复杂的疫苗接种策略相结合，常常导致免疫失败，使疾病防控日益困难。
在中国，控制IBV的疫苗接种策略高度异质且存在地区差异。肉鸡生产周期短，通常接种减毒活IBV疫苗，而种鸡和蛋鸡则常规免疫减毒活疫苗和灭活IBV疫苗。此外，IBV免疫程序通常涉及多种IBV血清型的组合。同时，IBV疫苗也常与新城疫病毒（NDV）疫苗联合使用，这进一步使免疫程序复杂化，并给IBV疫苗的研究，特别是在确保其质量、稳定性、安全性和效力方面带来了更多挑战。
为应对这些挑战，本研究旨在通过临床观察、病理学评估、系统发育和重组分析，对2023年获得的两株IBV分离株进行表征。这些结果将为了解4/91样IBV变异的分子进化和流行病学动态提供有价值的见解，并强调持续基因组监测、疫苗设计和免疫策略以改善家禽疾病控制的必要性。
2. 材料与方法
2.1. 伦理声明
样本采集和动物实验经南京农业大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并按照批准的指南进行。
2.2. 样本采集
样本采集自江苏和安徽省发生临床疾病的肉鸡场，这些鸡群在接种H120疫苗后出现了采食量减少、咳嗽和高死亡率等症状。收集患病鸡的气管和肾脏用于病毒分离。
2.3. IBV的分离
病毒分离如前所述进行。简单来说，采集的气管和肾脏样本分别匀浆并通过无菌滤器过滤，然后接种于9–10日龄的无特定病原体（SPF）鸡胚中。胚胎在37°C下培养144小时并每天照蛋观察。如果鸡胚出现发育迟缓和卷曲等典型病变，则认为样本对IBV呈阳性。IBV阳性样本在滴定前于SPF鸡胚中进行三次盲传；随后再进行两次传代以制备用于动物攻毒的病毒。使用Reed-Muench方法测定病毒的50%鸡胚感染剂量（EID50）。
2.4. 核酸提取与逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
使用TRIzol试剂从样本中提取总RNA。使用PrimeScript IV第一链cDNA合成试剂盒合成互补DNA（cDNA）。随后使用IBV特异性引物进行PCR扩增。此外，还检测了病毒悬液，以排除与其他常见禽类病原体的共感染。
2.5. 透射电子显微镜（TEM）观察
IBV的透射电子显微镜观察如前所述进行。将病毒悬液滴加至150目碳膜铜网上，吸附后用2%磷钨酸负染，干燥后在透射电镜下观察。
2.6. 对SPF鸡的致病性
使用7日龄SPF鸡评估分离株的致病性。30只SPF鸡随机分为三组：两个感染组和一个对照组。感染组鸡通过鼻内和眼内途径接种0.2 mL病毒悬液，对照组接种等体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。每天观察所有动物的临床症状、发病率和死亡率。感染后第14天对所有存活鸡进行安乐死。
2.7. 气管纤毛活性测定
每组使用15只SPF鸡进行气管纤毛活性测定。在感染后3、7和14天，每个时间点安乐死5只鸡，测定其气管纤毛活性。将气管浸入DMEM中，切成2 mm环，随机选取10个环在显微镜下观察。纤毛活性评分如下：0 = 100%活性，1 = 76%–99%，2 = 51%–75%，3 = 26%–50%，4 = 0%–25%。10个环的平均分代表每只鸡的纤毛损伤指数。同时收集气管、肺和肾脏组织，固定、脱水、石蜡包埋、切片并进行H&E染色，用于病理组织学观察。
2.8. 病毒基因组测序
使用23对引物通过RT-PCR进行全基因组测序。PCR产物纯化后克隆至pEASY-Blunt克隆载体中，转化后进行测序。使用SnapGene组装和编辑测序结果，重建病毒基因组序列。
2.9. 系统发育与重组分析
从NCBI GenBank下载代表性IBV基因型（GI-GVII）的基因组序列。使用ClustalW进行多序列比对，并重建系统发育树。分析的基因组区段包括结构蛋白基因（S1、S2、E、M和N）和非结构蛋白基因（1a、1ab、3a、3b、5a和5b）。
使用SimPlot v3.5.1进行Bootscan重组分析，参数设置为：窗口大小200 bp，步长20 bp，100次bootstrap重复，Kimura双参数模型，转换/颠换比=2.0，采用邻接法构建树。使用RDP v5.74进一步确认检测到的重组信号，并定位重组断点。
2.10. S1蛋白的结构建模与比较分析
为了阐明不同IBV基因型之间的结构差异，对分离株和参考疫苗株的S1蛋白序列进行同源建模。建模使用SWISS-MODEL服务器，以IBV刺突蛋白的晶体结构为模板。使用PyMOL v3.1.1可视化和比对预测的三维结构，以比较分离株与疫苗株之间的构象差异。
3. 结果
3.1. IBV的鉴定
本研究从临床样本中分离出两株IBV毒株，并在鸡胚尿囊液中连续传代五次。通过特异性引物的RT-PCR确认了两株分离株，并分别命名为CK/CH/JS/2302和CK/CH/AH/2307。这两株病毒接种9–10日龄SPF鸡胚后均诱导了典型的病变。接种CK/CH/JS/2302的鸡胚出现发育迟缓和卷曲，而感染CK/CH/AH/2307的鸡胚则表现为生长迟缓。透射电镜观察病毒悬液，显示直径约为80–100 nm的近似球形病毒粒子。
3.2. 分离株对7日龄SPF鸡的致病性
使用7日龄SPF鸡评估分离株的致病性。感染后鸡只表现出嗜睡、流鼻液和频繁甩头，严重情况下进展为咳嗽和喘气。 ∗∗p< 0.01; ∗∗∗p< 0.001.">
CK/CH/JS/2302组约20%的鸡在感染后第3天表现出抑郁和嗜睡，在第5-6天增加至30%，随后在第13天逐渐恢复正常。相比之下，CK/CH/AH/2307组仅有一只鸡在第4和第7天出现类似症状。超过50%的鸡在感染后第1天出现频繁甩头，第2天即恢复，这可能与鼻内和眼内接种引起的短暂刺激有关。从第3天起，两个感染组的鸡都出现了反复症状，并在第6天达到高峰。除了频繁甩头外，还观察到流鼻液。值得注意的是，CK/CH/JS/2302组的鸡表现出更高的发病率和更长的症状持续时间，持续到第13天，而CK/CH/AH/2307组的鸡在第10天即恢复。当流鼻液加重且未能缓解时，鸡只进展为咳嗽和喘气。约30%的CK/CH/JS/2302组鸡表现出这些呼吸道症状，其中一只在第5天死亡，死亡率为10%。对死鸡的剖检显示气管黏膜有瘀点状出血并伴有管腔内浆液性渗出，以及肾脏肿胀、苍白和呈斑驳状。相比之下，CK/CH/AH/2307组仅有一只鸡在第3天出现轻微咳嗽，未观察到死亡。这些鸡的剖检仅显示轻微的肾脏肿胀。
感染后第14天，在60%的CK/CH/JS/2302组鸡中观察到以瘀点状出血为特征的气管病变，其中四只还表现出气管管腔内有浆液性渗出。此外，该组70%的鸡出现肾脏肿胀，其中四只表现出苍白斑驳的肾脏。相比之下，CK/CH/AH/2307组仅有40%的鸡表现出轻微的肾脏肿胀，20%的鸡在气管黏膜上显示有限的瘀点状出血。
在感染后3、7和14天评估气管纤毛活性。两组鸡的纤毛均在感染后第7天出现显著损伤。然而，到感染后第14天，气管纤毛运动恢复到与对照组相同的水平。
感染后第7天采集的组织进行了组织病理学检查。在CK/CH/JS/2302组，观察到气管上皮出血和炎性细胞浸润，伴有纤毛上皮细胞碎裂和脱落。相比之下，CK/CH/AH/2307组的鸡仅表现出轻微的炎性细胞浸润。在CK/CH/JS/2302组鸡的肺部，支气管显示显著的黏膜上皮坏死和脱落。支气管管腔内充满大量含红细胞和炎性细胞的渗出物。炎症从支气管向周围组织离心性扩散，累及邻近肺泡，导致肺泡壁增厚和炎性细胞渗出，符合支气管肺炎的特征。在肾脏，CK/CH/JS/2302组观察到广泛的肾小管上皮细胞变性和坏死，以及出血。而CK/CH/AH/2307组的鸡在肺和肾脏均表现出轻微病变。
3.3. S1基因的系统发育分析
为了确定分离株的遗传分类，使用MEGA v11对CK/CH/JS/2302和CK/CH/AH/2307的S1基因序列进行了比对和分析。与NCBI数据库下载的参考序列进行的系统发育比较表明，两个分离株都聚集在GI-13基因型内，确认了它们属于4/91样毒株的分类。值得注意的是，CK/CH/JS/2302与东南亚参考毒株（如越南分离株IBHM-2021）的亲缘关系更近，而CK/CH/AH/2307则与欧洲参考毒株（如UK/2/91和4/91疫苗株）表现出高度相似性。具体来说，CK/CH/AH/2307与IBHM-2021、UK/2/91和4/91疫苗株的S1序列相似性分别为85.5%、96.9%和97.2%，而CK/CH/JS/2302的相应值分别为95.5%、88.9%和89.0%。
3.4. 结构与非结构蛋白基因的系统发育分析
基于结构蛋白基因（S2、M、N和E）的系统发育分析揭示了两株分离株之间不同的进化特征。CK/CH/AH/2307与GI-13（4/91疫苗株）谱系紧密聚类。相比之下，CK/CH/JS/2302的结构蛋白基因显示出更复杂的进化关系：S2基因与GI-22（LDT3-A）毒株关系更近，M基因与GI-7（GD）毒株聚类，而N和E基因则与包括GI-7（GD）、GI-22（LDT3-A）、GI-19（SD）和GI-13（GD17/04）在内的多个国内谱系表现出相对较近的关系。
对非结构蛋白基因（1a、1ab、3a、3b、5a和5b）的进一步分析揭示了相似的趋势。CK/CH/AH/2307在系统发育上仍接近GI-13（4/91疫苗株）谱系，而CK/CH/JS/2302则表现出复杂的进化模式。具体来说，1a和5a基因与GI-19基因型（SD）更接近，1ab基因与GVI-1基因型（GX-NN09032）相似度更高，3a基因与GI-19（SD）和GI-13（GD17/04）基因型均相关，而3b基因则与GI-7（GD）基因型聚在一起。
3.5. 重组分析
为了调查潜在的重组事件，使用SimPlot v3.5.1进行Bootscan分析，并用RDP v5.74进行验证。CK/CH/JS/2302在21,000–22,250 bp位置之间与IBV/India/ck/01/23表现出高度相似性。RDP分析显示，CK/CH/JS/2302中存在一个潜在的重组事件，亲本为GX-YL5（GI-19，作为主要亲本）和IBV/India/ck/01/23（GI-13，作为次要亲本），重组断点位于核苷酸位置21,145和22,244。相比之下，CK/CH/AH/2307与4/91疫苗株（KF377577.1）表现出高度的序列相似性，尤其是在4,750–10,000、14,000–19,000、22,000–25,750和26,000–27,500等区域。RDP验证确认，在CK/CH/AH/2307与所有代表性参考毒株之间未检测到重组事件。
3.6. 氨基酸序列分析与三维结构比对
基于结构蛋白（S2、M、E和N）氨基酸序列的系统发育分析表明，CK/CH/AH/2307与4/91疫苗株紧密聚类，而CK/CH/JS/2302则显示出更复杂的系统发育模式，与多个国内参考毒株共享遗传关系，包括GI-7（GD）、GI-22（LDT3-A）、GI-19（SD）和GI-13（GD17/04）。
然而，在刺突蛋白S1亚基中检测到多个氨基酸替换，主要分布在高变区（HVR）。在CK/CH/JS/2302中，在残基51–87、125–141和279–312处检测到不同的氨基酸替换，而CK/CH/AH/2307与4/91疫苗株相比显示出高度的序列保守性。
为了进一步评估S1蛋白的结构影响，使用SWISS-MODEL服务器预测了CK/CH/JS/2302、CK/CH/AH/2307以及常用疫苗株H120和QXL87的三维结构。使用PyMOL进行结构比对和可视化。计算出的均方根偏差（RMSD）值显示，CK/CH/JS/2302与H120、QXL87和CK/CH/AH/2307的RMSD值分别为0.054、0.079和0.021，表明CK/CH/JS/2302与CK/CH/AH/2307之间具有更高的结构相似性。
4. 讨论
IBV因其高度的遗传多样性、频繁的重组、广泛的组织嗜性以及由此引发的免疫逃逸和新变异株的出现，使其在家禽群中持续存在并造成经济损失。这些进化动态常常导致疫苗效力降低，使诊断和监测复杂化，并导致疾病难以控制。
本研究从先前接种H120疫苗的肉鸡群中分离出两株IBV野毒株，并通过病理学评估、系统发育和重组分析对其进行了表征。两株分离株均在SPF鸡中引起呼吸道疾病，包括流鼻液、频繁甩头、咳嗽和喘气。然而，CK/CH/JS/2302表现出更高的毒力，导致更长时间的严重呼吸道症状、10%的死亡率以及气管瘀点状出血和肾脏斑驳等病理病变。相比之下，CK/CH/AH/2307仅引起轻微的呼吸道症状和轻微的肾脏肿胀。这些结果表明，4/91样变异株之间存在毒力差异，这与之前关于突变和重组可导致毒力变异的报道一致。
系统发育分析将两株分离株都归类为GI-13（4/91样）基因型。然而，CK/CH/JS/2302显示出重组事件，其S1基因与越南毒株（IBHM-2021）密切相关，而结构蛋白和非结构蛋白基因则与包括GI-7、GI-19和GI-22在内的多种国内基因型具有更高的同源性。重组分析进一步确定了CK/CH/JS/2302中GX-YL5（GI-19，主要亲本）和IBV/India/ck/01/23（GI-13，次要亲本）之间的潜在重组事件。这种遗传交换事件被认为是IBV进化的主要原因，会导致组织嗜性和抗原性改变。与病理学评估一致，CK/CH/JS/2302引起的气管和肾脏组织损伤与其推测的亲本毒株GX-YL5相似。相比之下，CK/CH/AH/2307与4/91疫苗株表现出高度的基因组相似性，并且没有重组证据。这些特征与其在7日龄SPF鸡中相对较低的毒力一致。然而，CK/CH/AH/2307仍然诱导了显著的气管纤毛活性损伤，表明其保留了致病潜力，并可能容易继发感染。鉴于其紧密的遗传关系，CK/CH/AH/2307可能是4/91疫苗株在中国长期使用后通过遗传变异进化而来。需要进一步的病理学研究，特别是在1日龄SPF鸡中，以阐明其毒力特征。
S蛋白被认为是决定IBV组织和细胞嗜性的主要因素。比较系统发育和结构分析揭示，CK/CH/JS/2302中S1蛋白高变区I-III内的氨基酸替换导致了可能影响受体结合和抗原性的构象变化。结构建模进一步显示，受体结合域的改变可能影响受体亲和力和抗体识别。RMSD值表明，CK/CH/JS/2302与CK/CH/AH/2307具有高度的结构相似性，但与H120和QXL87疫苗株存在差异，这可能意味着有限的交叉保护。总之，基因组、结构和致病性分析共同阐明了在免疫压力下，遗传进化、免疫选择和致病性变异相互作用所塑造的当前流行4/91样IBV变异株的显著适应性。
总之，这项研究提供了证据，表明中国的GI-13谱系既包含重组毒株，也包含源自疫苗株的低毒力变异株，反映了同一基因型内不同的进化适应。观察到的分离株之间不同的致病性和基因组特征说明了IBV的持续进化以及重组与免疫选择之间的动态相互作用。重要的是，CK/CH/AH/2307与4/91疫苗株不同，并且表现出比CK/CH/JS/2302更低的毒力，这支持了其作为开发针对中国流行4/91样变异株的下一代疫苗候选毒株的潜力，这些变异株可能更适合中国的田间条件。这些发现强调了持续分子监测和基因型特异性疫苗设计的必要性，以对抗IBV的遗传和抗原多样性。基于流行基因型（特别是GI-13）的有效免疫策略，对于增强交叉保护、减少传染性支气管炎对家禽生产的经济影响至关重要。
