在大自然和人类健康、农业等领域，一种名为5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid， 5-ALA）的小分子扮演着日益重要的角色。它不仅是合成血红素、叶绿素和维生素B12等四吡咯化合物的“通用前体”，本身也极具商业价值，已获美国食品药品监督管理局（FDA）及欧盟批准用于皮肤癌的光动力诊断与治疗。在农业上，它还被证明是一种前景广阔的生态友好型调节剂，能够增强光合作用、激活抗氧化防御机制，并提升作物对非生物胁迫的耐受性，从而提高产量。
然而，尽管需求旺盛，高效生产5-ALA却充满挑战。虽然微生物发酵因其成本效益和低污染而成为优选策略，但产量常受限于多个因素。其中一个核心瓶颈是合成路径中的关键限速酶——5-氨基乙酰丙酸合酶（5-aminolevulinic acid synthase， ALAS）。作为一种异源表达的酶，ALAS在大肠杆菌等宿主中常常因折叠不当而形成“包涵体”，导致酶活性丧失。其催化效率严重依赖于正确的蛋白质折叠以及与辅因子磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate， PLP）的结合，因此，提高ALAS的可溶性表达是提升5-ALA产量的关键前提。此外，细胞内代谢流不平衡、前体供应不足、细胞应激以及发酵工艺放大困难等问题也制约着产量。
为了解决这一瓶颈，国立成功大学的研究团队开展了一项巧妙的研究。他们不再局限于传统代谢工程中对基因表达量的简单增强，而是将目光投向了细胞内蛋白质“质量控制系统”——分子伴侣（molecular chaperone）。这些分子伴侣如同细胞内的“折叠助手”，能够帮助新生的多肽链正确折叠、重新折叠被压力破坏的蛋白质，并防止其聚集。在大肠杆菌中，关键的伴侣系统包括触发因子（Trigger Factor， TF）、GroEL/GroES（GroELS）和DnaK/DnaJ（DnaKJ）。其中，DnaKJ系统以其在稳定新生多肽、防止早期聚集方面的突出能力而著称。
研究人员提出，将分子伴侣辅助的蛋白质折叠与代谢工程中的能量分配策略相结合，可能产生“协同效应”，从而突破ALAS表达限制，并优化整体的5-ALA生产效率。他们利用表达荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）ALAS（RcALAS）的工程大肠杆菌，系统性地探讨了这一策略的有效性。这项研究成果已发表在《New Biotechnology》期刊上。
为开展这项研究，作者们运用了几个关键技术方法：首先，分子伴侣工程与菌株构建，通过染色体整合和质粒共表达技术，构建了包含不同分子伴侣系统（TF、GroELS、DnaKJ）的重组大肠杆菌菌株库。其次，生理与代谢表征，包括使用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析蛋白质可溶性，通过艾氏试剂（Ehrlich’s reagent）比色法和高性能液相色谱（HPLC）分别定量5-ALA产量、碳源消耗及副产物，并使用ATP检测试剂盒测定胞内ATP水平。此外，在工艺优化与放大验证阶段，他们通过摇瓶培养优化了碳源（葡萄糖、果糖）选择和补料策略，并最终在2.5升的超高产量（Ultra-Yield™）培养瓶中进行了小试规模的发酵验证。
研究结果如下：
3.1. 不同分子伴侣的整合辅助了5-ALA的生物合成
研究发现，单纯表达RcALAS的对照菌株（RB）具有最高的生物量（4.04 g/L）。然而，当在宿主染色体中整合不同分子伴侣系统（TF、GroELS、DnaKJ）后，虽然所有菌株的生物量都因代谢负担而降低了约20%，但ALAS的可溶性却显著提高。其中，整合了DnaKJ系统的菌株（RK）表现最佳，其可溶性蛋白水平最高。这得益于DnaKJ系统在稳定新生多肽、防止早期聚集方面的突出作用。相应地，RK菌株的5-ALA产量也达到了6.46 g/L，是对照组的2.08倍。这表明，尽管伴侣整合增加了代谢负担，但由此带来的酶折叠效率提升，足以弥补生物量的损失，从而提高最终产量。
3.2. 质粒与染色体伴侣组合进一步提高了5-ALA产量
为了模拟细胞内伴侣系统的协同工作网络，研究人员进一步评估了染色体整合伴侣与质粒共表达伴侣的不同组合。结果表明，当DnaKJ基因与RcALAS基因在同一质粒上共表达时，无论宿主背景如何，都能将蛋白质可溶性提升到相近的高水平，这凸显了DnaKJ在维持蛋白质折叠能力中的核心作用。在所有这些菌株中，结合了染色体整合DnaKJ和质粒共表达DnaKJ的“RKK”菌株，在保持相对较高生物量（2.31 g/L）的同时，获得了最高的5-ALA产量——7.15 g/L，相比初始菌株提高了127%。这证明优化伴侣网络是平衡蛋白质质量控制与代谢生产力的有效策略。
3.3. 在伴侣组合下优化碳分配
由于DnaKJ系统的功能依赖于ATP驱动的结合-释放循环，高效的能量供应对高产5-ALA至关重要。研究人员比较了不同碳源（蔗糖、葡萄糖、果糖）对RKK菌株的影响。结果显示，葡萄糖为碳源时，菌株生长最好，5-ALA产量最高（7.47 g/L）。这归因于葡萄糖通过磷酸转移酶系统（PTS）直接进入糖酵解，能量损失最小。研究人员引入了一个“效率指数”（5-ALA产量/ΔATP）来衡量能量分配效率，发现葡萄糖组的指数最高（1.137）。这表明，相对ATP状态，而非绝对ATP丰度，与5-ALA的生产力更密切相关。
3.4. 通过优化碳补充策略进一步提升产量
鉴于高水平的DnaKJ表达带来了显著的ATP需求负担，研究人员设计了四种不同的葡萄糖补料策略来维持胞内能量平衡。研究发现，初始投入30 g/L葡萄糖（I30）的策略能支持较高的生物量和5-ALA产量（7.7 g/L），并保持更稳定的ATP池。而在初始30 g/L基础上，于24小时额外补充10 g/L葡萄糖（I30F10）的策略，能将5-ALA产量进一步提升至9.36 g/L（36小时），产量（g-ALA/g-葡萄糖）达到0.372，且效率指数高达3.973。这表明，维持葡萄糖浓度在20 g/L左右，可以实现碳供应、ATP池稳定性和生物合成输出之间的最佳平衡。
3.5. RKK菌株在高通气摇瓶中的最佳5-ALA生产
为了验证工艺的放大可行性，研究在2.5升超高产量摇瓶中进行小试。他们发现，过高的搅拌速率（250 rpm）虽然提高了生物量，但可能因产生过多的活性氧（ROS）导致氧化应激，反而使5-ALA产量下降至6.74 g/L。通过DPPH自由基清除实验证实，高搅拌速率确实降低了细胞的抗氧化能力。当搅拌速率降低至150 rpm时，细胞生长和碳利用情况与小规模培养相似，最终在48小时将5-ALA产量提升至12.1 g/L。同时，较低的搅拌速率下，胞内ATP水平随时间逐步增加，显示出更有利的能量状态，这与持续的5-ALA生物合成相吻合。
结论与讨论部分强调：
本研究成功地将分子伴侣辅助的蛋白质折叠策略与代谢工程的碳流调控相结合，为高效生产5-ALA提供了一条创新路径。主要结论在于：
- 1.
DnaKJ伴侣系统是关键杠杆：染色体整合DnaKJ显著增强了ALAS的可溶性，而进一步的质粒共表达则稳定了蛋白质折叠质量及PLP辅因子的结合，使最佳工程菌RKK在摇瓶中达到了7.15 g/L的5-ALA产量。
- 2.
能量供应与分配至关重要：在依赖伴侣辅助的菌株中，葡萄糖因其高效的碳流转化而成为最优碳源。同时，精心设计的补料策略对于维持稳定的ATP池、协调细胞能量与5-ALA生物合成之间的平衡起到了决定性作用，最终将产量提升至9.36 g/L。
- 3.
放大过程需精细调控氧传递与能量平衡：在小试放大过程中，研究揭示了搅拌速率对氧化应激和能量分配的深刻影响。过高的搅拌虽利于氧传递，但会引起能量错配和代谢溢流，而适中的搅拌（150 rpm）则能在保证供氧的同时，维持较低的氧化应激和有利的能量状态，从而在2.5升规模上实现了12.1 g/L的高产量。
这项工作的重要意义在于，它超越了传统代谢工程中单纯增强基因表达的范式，通过“自上而下”地优化细胞内蛋白质折叠这一基础生命过程，并与“自下而上”的碳代谢流重定向相结合，实现了对复杂生物合成路径的协同强化。这不仅为5-ALA的高效、可扩展生物制造提供了具体可行的解决方案，也为利用分子伴侣工程解决其他依赖复杂或易聚集异源酶的生产瓶颈提供了宝贵的范例和理论依据。
