引言
全球气候变化和人口激增加剧了粮食资源不足问题，因此通过高值化利用食品生产过程中的副产物（例如猪皮）变得尤为重要。猪肉加工的副产物猪皮（约占猪肉总质量的8%）通常直接用作饲料或被丢弃，导致大量猪皮资源未被充分利用，造成资源浪费和环境污染。猪皮可作为优质的胶原蛋白来源，其胶原含量超过80%。因此，利用猪皮等副产物中的功能性物质（如胶原蛋白）将为屠宰场副产物的高值化利用提供契机。
目前，胶原的应用主要集中在两类产品：明胶和胶原肽。明胶广泛用作糖果、酸奶等产品中的食品添加剂。胶原肽则在美容和健康领域作为营养补充剂，用于改善皮肤健康和降低心血管疾病风险。然而，就产业规模而言，这两类产品远不能完全利用肉类加工产生的大量胶原副产物。迫切需要通过产品创新来扩大胶原的高值化利用。
值得注意的是，由于天然胶原热稳定性低且难以降解，市场上基于胶原大分子开发的大众休闲食品很少。一方面，在常规食品加工和储存中，天然胶原因其易变性和降解性，严重限制了其工业应用。另一方面，胶原大分子被认为难以被胃肠道有效消化，导致生物利用度低，人体难以充分利用。为解决胶原热稳定性差的问题，本研究团队利用转谷氨酰胺酶（TGase）交联修饰技术成功制备了具有优异热稳定性的胶原凝胶。该方案解决了胶原产品在加工和储存过程中的稳定性问题。关于胶原消化性问题，传统观点认为蛋白质交联会降低其生物利用度。然而，近期研究表明，适度的TGase交联实际上可以提高蛋白质消化率。Sha等人的体外研究显示，胶原衍生物的交联程度随TGase浓度增加而增加，随之而来的是胃和肠道消化率的逐渐提高，尤其是胃消化率。此外，适当的交联增加了含羟脯氨酸胶原肽的数量。我们初步的体外消化实验也证实，在模拟胃肠道消化过程中，TGase交联胶原凝胶的水解度显著增加，新增的酶切位点主要集中在谷氨酰胺-赖氨酸交联位点周围。尽管如此，相关研究仍限于体外实验，缺乏体内消化吸收的直接证据。
本研究以猪皮为原料，制备了不同浓度的胶原溶胶和TGase交联胶原凝胶等体系。利用小鼠体内消化模型和蛋白质组学技术，分析并阐释了TGase交联胶原凝胶相较于其他胶原体系在消化吸收特性上的变化。此外，还研究了TGase交联胶原凝胶对小鼠血清代谢物的影响。旨在阐明TGase交联胶原凝胶的体内消化吸收特性，为利用猪皮等加工副产物开发品质优良、营养价值高的胶原产品提供理论基础。
材料与方法
研究采用了食品级脱脂猪皮、生化级木瓜蛋白酶、TGase（200 U/g）、分析纯蔗糖脂肪酸酯和分析纯NaCl等材料。
胶原基样品的制备过程包括：清洗并切块猪皮，在0.06%蔗糖脂肪酸酯溶液中超声脱脂，用纯水清洗，在10% NaCl溶液中静置15分钟去除杂蛋白，在高压锅（70 kPa; 120℃; 50分钟）中焖煮，取出猪皮用胶体磨研磨获得胶原溶胶。使用400 U/mL木瓜蛋白酶溶液（60°C，40分钟）水解胶原溶胶，并于100°C灭活，制备水解胶原溶胶。随后，水解胶原溶胶用20 U/mL的TGase溶液在45°C下交联120分钟，并在交联结束时用沸水灭活，获得TGase含量为0.5 wt%的TGase交联胶原凝胶（CGL）。作为对照组的未交联水解胶原溶胶（CSL）通过用纯水替代TGase溶液获得，而胶原溶胶稀释液（CST）则通过将CSL稀释十倍获得。CSL和CST样品将用于后续体内消化的对照试验。
体内消化吸收试验将28只C57BL/6J小鼠（雄性，20±2 g）分为空白组（Con）、胶原溶胶稀释液组（CST）、水解胶原溶胶组（CSL）和TGase交联胶原凝胶组（CGL）。小鼠在温控动物房中饲养，光暗交替（12小时），室温为22±3°C。在正式试验开始前，所有小鼠适应环境一周，期间自由进食饮水。一周后，CST（0.2 g/kg）、CSL（2 g/kg）和CGL（2 g/kg）组每天灌胃一次，持续一周，期间小鼠正常进食饮水。在实验最后一天，灌胃3小时后，麻醉状态下采血，离心血清并冷冻保存。胃和肠道内容物冷冻保存。
肽组学分析采用通用的液相色谱-质谱联用（LC-MS）方法定量未消化的肽段。对于血清样品，加入等体积的3 M盐酸胍、3 M尿素和2 mM PMSF，于4°C反应60分钟。加入预冷的乙腈，振荡，于4°C反应15分钟。对于其他样品，收集上清液并用水稀释乙腈浓度至17.5%。上清液经10 K超滤，收集滤液。滤液冻干后用C18柱脱盐。此外，分别取400 µg小肠、盲肠和胃样品，用0.1% TFA/H2 O复溶，并与血清肽样品一同使用C18脱盐柱脱盐。
肽样品通过进样器结合到C18柱上，然后洗脱到分析柱（1.9 µm, 100 Å, 75 µm x 20 cm）上进行分离。使用两种流动相建立分析梯度：流动相A为含0.1%甲酸的水，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脱程序在600 nL/min的恒定流速下进行。然后在质谱仪中进行质谱分析，母离子扫描范围为m/z 300–1400，子离子扫描范围为m/z 100。
搜索使用的数据库是从Uniprot网站下载的Sus scrofa（猪）蛋白质数据库。胶原序列来源于NCBI数据库。通过Venn图展示特异性肽段的数量。使用肽谱图映射网站对特异性肽段进行肽谱图映射。
血清代谢组学分析同样采用LC-MS进行。样品在80%甲醇水溶液中复溶，混匀后低温静置5分钟，低温离心20分钟（15,000 g）。在收集的上清液中加入质谱用水后，再次进行低温离心。收集上清液，使用Vanquish UHPLC和Q Exactive™ HF-X质谱仪组成的系统进行LC-MS分析。液相色谱柱为Hypersil Gold C18柱。柱温和流速分别为40°C和0.2 mL/min，流动相A和B分别为0.1%甲酸和甲醇。质谱扫描范围选择m/z 100–1500。
测定数据通过数据库软件处理。每个代谢物通过保留时间和质荷比等参数进行初步筛选，并通过质控（QC）样品校正以确保鉴定的准确性。以5 ppm的质量偏差和30%的信号强度偏差进行峰提取和峰面积定量。然后将获得的预测分子式与数据库比对，并进行归一化处理，去除背景后得到相对峰面积。最后，排除QC样品中变异系数（CV）大于30%的分子，获得最终的代谢物鉴定和定量结果。
通过KEGG数据库对鉴定出的代谢物进行注释。使用代谢组学分析软件（Meta X）对数据进行多变量统计分析，主要包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），并获得代谢物的VIP值。通过t检验进行组间代谢物显著性分析，并进一步计算组间差异倍数（FC）。选择VIP>1、P值<0.05和FC>1.2的标准绘制火山图并筛选代谢物。最后，利用KEGG数据库探索差异代谢物的代谢途径和功能。
血清游离氨基酸测定方法为：向50 µL血清中加入50 µL NaOH（4 M）和200 µL甲醇，在12,000 rpm下振荡30秒/离心15分钟，取上清液至玻璃试管。加入34 µL吡啶和20 µL氯甲酸甲酯（MCF），涡旋30秒。再加入20 µL MCF，涡旋30秒。之后加入400 µL氯仿，涡旋10秒。加入400 µL NaHCO3 （50 mM碳酸氢钠），涡旋10秒。然后在2000 rpm下离心10分钟，轻轻吸取。弃去上层水相和中间蛋白层，在下层氯仿层中加入硫酸钠（粉末，绿豆大小）吸收水分，并将150–200 µL该液体转移至样品瓶中进行GC-MS进样分析。GC-MS仪器参数参考Gao等人的方法设置。
数据使用SPSS 27.0软件进行统计分析，数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析（ANOVA）并通过LSD检验确定组间显著性差异。“”代表p<0.05，“ ”代表p<0.01，“ **”代表p<0.001。
结果与分析
3.1 胃肠道消化液中肽谱分析
通过使用校准曲线分析色谱图中的峰面积来确定胶原肽的分子量分布。对小鼠胃、小肠和结肠内容物中鉴定出的胶原肽段的平均分子量进行统计和计算，结果显示，CSL组胃内容物中胶原肽段的平均分子量最高（1019.66 Da），而CGL组最低（803.78 Da）。这表明交联处理可能增加了CGL在胃中的消化时间，使其更容易被胃蛋白酶水解成更小的肽段。相比之下，未交联的CSL可能因其松散的结构而部分抵抗胃蛋白酶的完全降解，保留了较大的肽段。在小肠内容物中，CSL和CGL组的肽段平均分子量进一步增加到1178.17 Da和1015.26 Da，而CST组呈下降趋势（861.89 Da）。在盲肠内容物中，CGL组肽段的平均分子量（978.53 Da）高于CSL组（810.28 Da）和CST组（819.29 Da）。这些数据表明，在肠道消化阶段，小肠中的蛋白酶持续将CGL降解为肽段，这些肽段可能未被完全吸收，导致更多高分子量肽在盲肠中积累。
此外，对消化液中胶原肽的详细分析显示，在胃内容物中，不同处理的胶原样品表现出明显的分子量分布差异。其中，CGL组显示出最高的消化程度，其<500 Da的肽段比例（11.22%）高于CST组（3.47%）和CSL组（3.62%），而>1500 Da的肽段比例（2.04%）最低。这表明交联处理可能增强了胶原在胃酸环境中的酶敏感性，使其更容易被胃蛋白酶介导降解为小肽。相比之下，CSL组中1000–1500 Da肽段（30.43%）和>1500 Da肽段（8.7%）的比例更高。这表明其结构可能更松散，但仍能部分抵抗胃蛋白酶的完全降解。CST组的肽段分布介于两者之间，可能是由于稀释降低了胶原聚集程度，使其更容易被胃蛋白酶部分水解，但仍保留了更多500–1000 Da范围内的肽段（66.67%）。
在小肠消化阶段，CGL组保持了较高的消化程度，其<1000 Da的肽段比例高于CSL组，而≥1000 Da的肽段比例较低。这表明，与CSL相比，CGL的交联作用使其能够被小肠中的蛋白酶分解成更多小分子肽（<1000 Da）。进入盲肠后，CSL组的小肽（<500 Da）比例最高（11.02%），CGL组最低（3.85%）。500–1000 Da肽段的比例在CST组最高（76.87%），CSL组仍然较高（74.58%），但CGL组较低（57.69%）。同时，与CST和CSL组相比，CGL组在1000–1500 Da（31.73%）和>1500 Da（6.73%）分子量范围内的肽段比例最高。有趣的是，在小肠阶段，CGL组中<1000 Da的肽段比例高于CSL组，但在盲肠阶段，CGL组中<1000 Da的肽段比例却低于CSL组。这种相反的趋势表明，具有交联结构的CGL可能被肠道中的蛋白酶降解成更多小肽，这些小肽随后在小肠中被吸收。
所有TGase处理的胶原凝胶组在消化后均产生了丰富的胶原肽。在CST、CSL和CGL组的胃内容物中，分别检测到144、138和98个胶原肽；在小肠内容物中，分别检测到250、496和219个胶原肽；在盲肠内容物中，分别检测到134、118和208个胶原肽。对各消化阶段肽段数量的分析表明，与CST和CSL组相比，CGL组在胃和小肠阶段的肽段数量较少，但在盲肠阶段的肽段数量较多。这进一步表明TGase的交联作用可能在CGL中创造了更多的消化位点，导致在胃和小肠阶段发生更大幅度的降解并产生更多肽段，而小肽更容易在小肠中被吸收。这与Sha等人的发现一致，即适度的交联促进了胃蛋白酶对胶原的水解。
此外，羟脯氨酸是胶原特异性氨基酸。在CST、CSL和CGL组的胶原肽段中，胃内容物中羟脯氨酸胶原肽的相对含量分别为30.56%、27.54%和30.61%；小肠内容物中分别为84.00%、86.29%和80.37%；盲肠内容物中分别为34.33%、22.88%和70.19%。TGase交联胶原凝胶对消化产物中羟脯氨酸肽的含量有影响。由于耐热胶原凝胶特殊的凝胶特性，各组样品在体内胃肠道消化后可能产生一些独特的胶原肽。因此，我们分析了各组样品间独特胶原肽的数量。在CST、CSL和CGL组的胃内容物中，分别检测到112、105和78个独特胶原肽。在小肠内容物中，分别检测到106、162和36个独特胶原肽。在盲肠内容物中，分别检测到98、89和161个独特胶原肽。因此，TGase的交联作用使CGL在体内消化过程中产生特殊的肽段，这可能赋予CGL特殊的功能活性。
3.2 血清肽谱分析
在大鼠血清中鉴定出的肽段用于代表TGase交联胶原凝胶在小鼠体内的吸收情况。在CST、CSL和CGL组的血清中，分别检测到118、141和205个胶原肽。羟脯氨酸胶原肽的相对含量分别为84.75%、88.65%和93.66%。在小鼠血清中，CGL组胶原肽段的平均分子量（1274.46 Da）低于CST组（1274.82 Da），而CSL组胶原肽段的平均分子量最高，为1376.54 Da。详细的血清平均分子量分析显示，CST组分子量低于500 Da的胶原肽段比例最高（4.24%）。在500–1000 Da分子量的胶原肽比例中，CST组最高，为33.05%。在1000–1500 Da分子量的胶原肽段比例中，CGL组最高，为40.49%。在分子量大于1500 Da的胶原肽比例中，CSL组最高，为34.04%。
此外，在CST、CSL和CGL组的血清中，分别检测到14、23和76个独特的胶原肽。通过肽数据库预测了各组血清中吸收肽段的潜在生物活性（预测概率越接近1，表示Peptide Ranker认为该肽具有生物活性的置信度越高）。对生物活性肽的预测数量分别为1、4和17个。
为了进一步阐明TGase交联胶原凝胶的消化吸收特性，我们对小鼠血清中吸收的猪皮胶原肽进行了肽位点分析。我们选择了I型胶原的α1链（蛋白编号A0A5G2QQE9），这是猪皮胶原中最丰富的I型胶原，进行消化位点分析。CST、CSL和CGL产生的特异性肽段在I型胶原α1链上的肽谱图显示，CGL组具有更多消化区域且强度更大。
随后绘制了吸收肽在胶原α1链上的分布图。结果表明，排除相同的肽段后，CGL组特有的消化位点数量更高。I型胶原α1链的三螺旋区域主要位于Gly111和Pro1179之间。CGL组特有的消化位点主要位于氨基酸序列位置141–161、213–317、432–568、636–828、882–1018和1128–1193的氨基酸序列位点，所有这些都位于三螺旋样区域内。此外，在我们之前的研究中发现，TGase在I型胶原α1链中的交联活性位点主要位于Lys644、Lys738和Gln972。如图所示，CGL组在Lys644、Lys738和Gln972位点周围有密集的剪切位点，而这些在CSL和CST组中并未出现。这可能是由于TG酶的交联作用改变了交联位点附近的分子结构，从而增加了体内胃肠道消化过程中的酶切位点，进一步增强了耐热胶原凝胶的吸收效果。
血清肽谱分析表明，CGL组吸收的胶原肽数量（205个）和羟脯氨酸肽比例（93.66%）显著高于其他组，并且其特异性肽段密集分布在I型胶原α1链的三螺旋区域（例如Lys644和Gln972周围）。这些区域通常因其紧密的结构而难以被消化酶识别，但TGase交联可能通过局部构象变化来提高酶的可及性。CGL组更高的吸收率可能归因于CGL的凝胶状态减慢了胃排空速率，使得羟脯氨酸肽有更充分的时间进行活跃的肠道转运。同时，在CGL组血清中预测到的生物活性肽数量最多（17个），大量胶原肽含有GPP等序列，表明其消化产物可能具有抗氧化功能，但其具体功能需要通过后续实验验证。胶原肽已被证明可以促进皮肤和骨骼中的胶原合成。TGase交联胶原凝胶的吸收特性为胶原肽的功能性应用提供了新思路。
3.3 血清游离氨基酸分析
胶原消化过程中产生的游离氨基酸被吸收进入血浆和肠道。因此，血清中检测到的氨基酸与消化液的吸收特性相关。从血清氨基酸的角度看，摄入TGase交联胶原凝胶对正常小鼠血清氨基酸的影响主要包括半胱氨酸、谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸。
与空白组相比，CGL组的血清半胱氨酸、谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸、甘氨酸和羟脯氨酸水平显著升高，而天冬酰胺、异亮氨酸、丙氨酸和脯氨酸含量显著降低。与CST组相比，CGL组的血清甘氨酸和羟脯氨酸水平显著升高，丙氨酸水平显著降低。与CSL组相比，CGL组的血清丙氨酸含量显著降低。可见，CGL组的氨基酸谱保留了胶原的基本营养特性，并且与CSL和CST组相比，展示了交联修饰带来的独特优势。
就特征性氨基酸而言，首先，CGL组的羟脯氨酸水平（7.20 µmol/L）显著高于空白组（3.02 µmol/L），接近CSL组的最高水平（7.78 µmol/L）。这一结果直接证实了CGL中胶原的有效消化和吸收，因为羟脯氨酸是胶原的特征氨基酸，其血清水平升高反映了胶原肽的成功转运。血清羟脯氨酸含量的增加促进了胶原合成反应。其次，就甘氨酸含量而言，CGL组（46.58 µmol/L）显著高于空白组（29.94 µmol/L）和CST组（38.06 µmol/L），在所有组中达到最高水平。作为胶原中最丰富的氨基酸，甘氨酸血清水平的升高进一步验证了CGL的消化吸收效率。特别值得注意的是，CGL组的甘氨酸水平甚至高于CSL组（44.73 µmol/L），这可能与交联结构改变了胶原的消化动力学有关，使得甘氨酸更容易以肽段形式被吸收。
关于其他功能性氨基酸，CGL组的谷氨酸水平（5.87 µmol/L）在所有组中最高，表明CGL可能通过谷氨酸代谢途径影响机体的抗氧化状态。CGL组保持了较高的必需氨基酸水平，例如苏氨酸（15.60 µmol/L）和赖氨酸（30.12 µmol/L），这表明CGL能够提供全面的氨基酸营养。从营养学角度来看，CGL是一种有效的胶原补充形式，并为开发基于交联胶原的功能性食品提供了科学依据。
3.4 血清代谢组学分析
3.4.1 代谢物的组间多变量统计分析
为了探索各组小鼠血清中的代谢差异，使用PLS-DA模型检验两组间的分离程度，并筛选不同组间的差异代谢物。结果显示，Con vs. CST、CSL vs. CGL和CST vs. CGL组中任何两组的样本都清晰地分离开。各比较组的模型评估参数和模型检验结果显示，PLS-DA模型参数为R2 >0.97且Q2 >0.38，并且Q2 回归线与Y轴的截距小于0。这表明PLS-DA模型可靠且未过拟合。这些结果表明，摄入TGase交联胶原凝胶的小鼠体内内源性代谢物发生了明显变化。
3.4.2 差异代谢物分析
基于单变量统计（包括差异倍数分析和t检验）对检测到的代谢物进行差异分析。设定阈值为VIP>1.0、FC>1.2且P值<0.05来筛选差异代谢物。各组差异代谢物的整体分布以火山图形式呈现。结果表明，与CGL组相比，Con与CGL组之间的差异代谢物最多，CSL与CGL组之间最少。Con和CGL组之间有262个代谢物存在差异，包括正离子模式下的168个和负离子模式下的97个。CST和CGL组之间共有181个代谢物存在差异，包括正离子模式下的104个和负离子模式下的77个。CSL和CGL组之间注释到的差异表达代谢物数量为122个，包括正离子模式下的71个和负离子模式下的51个。
3.4.3 差异代谢物的生物信息学分析
随后，使用KEGG数据库进行差异代谢物富集通路分析。通路富集能够识别差异代谢物涉及的最突出的生化代谢途径和信号通路，从而确定TGase交联胶原凝胶在小鼠体内改变的血清代谢途径。根据上述富集结果，绘制了富集的KEGG通路气泡图。
结果表明，与空白组相比，CGL摄入调控的小鼠主要血清代谢通路包括类固醇激素生物合成、维生素B6代谢、色氨酸代谢、AMPK信号通路和咖啡因代谢。与CST组相比，CGL摄入调控的小鼠主要血清代谢通路包括谷胱甘肽代谢、矿物质吸收、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成以及磷酸戊糖途径。与CSL组相比，CGL摄入调控的小鼠主要血清代谢通路包括色氨酸代谢、醛固酮合成和分泌、苯丙氨酸代谢、维生素消化和吸收以及脂肪酸降解。
膳食蛋白质在体内被消化水解产生肽和氨基酸，当这些不同的消化产物参与体液循环时，会调节体液中的代谢物水平。因此，蛋白质的消化吸收水平和程度可以对生物体的体液代谢组学产生影响。在典型的代谢通路分析中，发现CGL摄入显著改变了小鼠血清中与代谢相关的通路。例如，类固醇激素合成通路在Con vs. CGL组中显著富集，CGL组中醛固酮、17α-羟基孕烯醇酮（17-OH PREG）、脱氢表雄酮（DHEA）和雌三醇等关键代谢物显著升高。醛固酮是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的重要组成部分，在心血管稳态、血压和心血管重塑的调节中起着重要作用。其中，17-OH PREG能有效减轻MASH诱导的肝损伤，表明其对组织损伤具有普遍的保护作用。DHEA可能通过促进胶原纤维的发育和成熟，并减少与角质形成细胞终末分化和角化相关的其他基因，从而对皮肤产生抗衰老作用。此外，作为DHEA的下游代谢物，血清雌三醇水平显著升高，进一步说明了DHEA在代谢途径中的高代谢活性。在色氨酸代谢通路显著富集中，CGL组血清中吲哚衍生物如5-甲氧基吲哚乙酸（5-MIAA）、吲哚丙酮酸和吲哚-3-乙醇显著减少，表明CGL可能通过调节肠道菌群的变化导致吲哚衍生物产生减少。对维生素B6代谢通路的显著影响表现为CGL组中4-吡哆酸和吡哆胺磷酸显著上调，而吡哆胺显著下调。这种调节模式表明CGL增强了体内维生素B6的利用，并加速了维生素B6的分解代谢。
此外，在CST组 vs. CGL组中，谷胱甘肽代谢通路出现富集。这主要表现为CGL组中（5-L-谷氨酰）-L-氨基酸和抗坏血酸盐显著减少，而5-氧代脯氨酸和精胺显著增加，这可能归因于CGL通过促进体内产生 更 多 谷 胱 甘
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