在现代工业生产中，对可持续发展的迫切需求使得制造活动与环境保护之间的兼容性成为一个关键问题。因此，绿色制造和清洁生产在化学工业中变得越来越重要。为了实现这些目标，特别是基于酶的生物合成方法越来越多地被用来替代传统的化学工艺。与传统化学合成不同，酶促反应不仅在温和且环保的条件下进行，还能合成使用传统有机化学难以生产的复杂化合物（Zhang等人，2022年）。此外，酶具有一系列理想的催化特性，包括通过微生物表达实现高效生产、高立体选择性、特定的底物特异性以及显著的催化效率。基因工程和酶分子修饰的进步进一步增强了它们的适用性，使得酶介导的生物合成成为高价值精细化学品生产中不可或缺的技术（Sheldon等人，2020年；Sheldon，2024年；薛雅萍等人，2018a年）。
尽管酶催化在生物合成领域展现了显著的优势，但在许多工业生产过程中，依赖单一酶催化的反应仍面临重大限制。复杂化学品的合成通常需要多步骤反应，往往需要多种酶的协同作用才能高效且连续地完成转化过程。因此，多酶催化系统的开发已成为生物制造领域的关键策略（Peng等人，2024年）。随着酶工程和生物反应器技术的不断发展，多酶组合催化已在许多生物催化案例中取得成功应用（Benítez-Mateos等人，2022年；Wang等人，2017年）。此外，为了提高反应经济性和效率，多酶系统中引入了辅酶再生系统，如NADP+/NADPH（Cao等人，2021年）、NAD+/NADH（Marchini等人，2022年）和ATP/ADP（Tavanti等人，2021年），通过共底物循环实现高效酶催化，进一步增强了系统的可持续性。同时，酶催化经常与光催化、过渡金属催化、电催化和有机催化等非生物催化策略结合，形成混合催化系统，大大扩展了反应设计和底物适用性的可能性（Milam等人，2025年；Rudroff等人，2018年）。目前，基于酶级联反应的生物制造技术已广泛应用于食品、制药、纸浆加工、皮革处理、生物燃料、洗涤剂和饲料等行业，显示出广阔的工业应用前景和显著的经济价值（Bergquist等人，2020年）。
多酶级联系统由两种或更多种酶组成，这些酶催化不同类型的反应，通常可以分为五种基本模块（Benítez-Mateos等人，2022年）：线性、并行、正交、循环和三角（图1）。与单酶催化系统相比，这类系统在反应效率、原子经济性和过程强化方面具有显著优势。然而，构建高效的多酶级联系统需要对多个反应步骤进行深入的热力学和动力学分析，以满足催化兼容性和环境兼容性要求，从而为酶的空间组装提供理论基础（France等人，2016年；Klermund等人，2017年）。一旦系统构建完成，优化其整体性能成为实际工业应用中的关键挑战。
在过去几十年中，研究人员主要通过基因工程对单个酶进行分子修饰，以提高其催化性能、稳定性和底物适应性。在这方面取得了显著成就，例如醇脱氢酶（ADH）（Qu等人，2021年）、羧酸还原酶（CAR）（Yating Hu等人，2020a年）和黄素单加氧酶（FMO）（B.-Y. Sun等人，2022a年），这些酶经过蛋白质工程优化后已成功应用于工业生产。然而，酶的催化性能存在理论极限。当限速酶的活性接近其自然上限时，通过单酶分子进化进一步提高整体级联效率变得越来越无效。因此，研究重点逐渐从“单酶优化”转向“系统优化”，即通过调节酶的空间组织来提高多酶系统的整体通量和协同效率。
为了克服单酶优化的局限性，通过酶固定实现空间共定位成为一种关键策略。传统方法如吸附、包封、交联和共价键合可以增强酶的稳定性和操作便利性，但它们本质上会导致酶的随机组装（L.-Q. Jin等人，2019a年；Kim等人，2021年；Lin等人，2021a年；Xu等人，2025年）。这种随机性常常导致构象变化、活性丧失和酶间协同作用效率低下，无法复制天然多酶系统的高效率（Guimarães等人，2022年；Lin等人，2020年；Maghraby等人，2023年）。相比之下，天然酶复合物（如糖酵解和聚酮合酶（PKSs）通过明确的空间组织实现了高催化效率，从而实现底物通道化和动力学耦合（Sweetlove和Fernie，2018年）。这突显了精确纳米尺度酶定位对于高效级联催化的重要性（Almeida等人，2021年），促使研究从传统的共固定转向精确组装工程。
人工多酶系统根据载体类型大致分为两类：非生物材料和生物材料，如图2所示。非生物载体包括合成聚合物和无机载体，通过物理或化学相互作用促进酶的固定。然而，由于表面性质和微观结构的不利，它们的生物相容性有限，可能导致酶的不稳定性和活性丧失（Rodriguez-Abetxuko等人，2020年）。尽管如此，它们可调的形态和机械强度支持了广泛的应用。相比之下，生物材料如核酸、蛋白质、多糖和微生物细胞具有优异的生物相容性、内置的分子识别能力和模块化特性。这些特性使得通过展示系统或内源性机制实现精确的酶组装成为可能，更好地保持酶活性并支持可持续的生物制造，因为它们具有固有的生物降解性和可再生性（Dong等人，2021年；Hwang和Lee，2019年）。
尽管经过多年的发展，多酶组装技术的应用范围不断扩大，组装策略也日益多样化。天然酶复合物的精确结构和化学固定方法为维持酶活性和实现高效组装提供了宝贵见解。然而，大多数现有研究集中在无序组装策略上，难以精确控制酶分子的空间定位。酶定位的随机性往往限制了底物通道效应和级联催化效率的进一步改进（Bié等人，2022年；Quin等人，2017年）。因此，开发能够实现有序酶排列的新组装方法以优化反应流程和能量耦合成为构建多酶系统的迫切需求。为了解决这一挑战，有必要针对不同类型的级联反应（如线性、并行、正交、循环和三角）研究定制的有序组装策略。无论使用生物来源还是合成来源的载体材料，都需要结合它们的物理化学性质和酶学特性来设计定制的工程解决方案，以实现多酶的合理空间排列。在本研究中，基于对传统无序组装方法的回顾，我们提出了一种以“有序组装”为中心的新范式，旨在通过可控和可预测的酶定位策略最大化级联反应效率。当前的研究已经证明了这一方向的可行性和潜力，例如设计和构建可编程的人工分子框架（如金属有机框架、DNA纳米结构），为多酶组装提供了新的工程方法，并支持下一代高效稳定的人工酶分子机器的发展。
