SIX2介导的小胶质细胞M2极化与外来体miR-3470b递送保护帕金森病多巴胺能神经元
1. 引言
帕金森病（Parkinson's Disease, PD）是一种以中脑黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）多巴胺能神经元进行性变性死亡为特征的神经退行性疾病。其临床表现包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳等运动症状。当前的药物治疗主要旨在提高脑内多巴胺水平，例如使用左旋多巴和多巴胺受体激动剂。然而，这些疗法无法从根本上减缓或阻止多巴胺能神经元的进行性死亡。因此，寻找能够延缓或阻止多巴胺能神经元变性的新治疗靶点，仍然是PD治疗中的主要挑战。
神经炎症在PD的发病机制和进展中起着至关重要的作用。作为大脑中的常驻巨噬细胞，小胶质细胞与PD的发生发展密切相关。活化的胶质细胞表现出双重表型：（i）“经典激活”的促炎、神经毒性的M1表型；（ii）“替代激活”的抗炎、神经保护的M2表型。M1型小胶质细胞释放TNF-α、IL-6和iNOS等促炎因子，导致神经元损伤并释放损伤相关分子，进而放大炎症反应，加速PD进展。相反，M2型小胶质细胞产生高水平的ARG-1、IL-10和CD206，以及血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子等生长因子，促进周围细胞的修复和大脑的稳态环境。在某些条件下，M1/M2型小胶质细胞可以相互转换。因此，促使小胶质细胞从M1表型向M2表型转变，对于减轻或逆转PD中多巴胺能神经元的进行性死亡至关重要。
鉴于神经炎症在PD进展中的关键作用，识别小胶质细胞活化和极化的关键调节因子至关重要。其中一个潜在的调节因子是转录因子Sine oculis homeobox homolog 2 (SIX2)，这是一种在健康成人中基本沉默的发育转录因子。然而，在组织损伤或应激时，SIX2被迅速重新激活并发挥强大的抗炎作用，这在脂多糖（LPS）诱导分化的巨噬细胞中已得到证实。在中枢神经系统中，我们先前的研究表明，SIX2在炎症小胶质细胞中表达显著上调，抑制LPS诱导的神经炎症并保护共培养的多巴胺能神经元。尽管有这些发现，SIX2发挥这些有益作用的确切机制仍不清楚。
除了其直接的抗炎作用外，SIX2还可能通过外来体调节细胞间通讯。外来体是纳米级细胞外囊泡（30–150 nm），携带非编码RNA、蛋白质和脂质。在大脑中，小胶质细胞来源的外来体在调节神经炎症和神经元存活方面起着关键作用。值得注意的是，抗炎（M2）小胶质细胞分泌的外来体已被证明携带神经保护性物质，如特定的miRNA，并且在被摄取后能够促进神经元存活。外来体保护其内部物质，特别是微小RNA（miRNA），免受降解，从而实现有效的细胞间通讯。新出现的证据表明，调节外来体miRNA谱可能介导神经退行性疾病中的细胞间通讯。这就提出了一个有趣的问题：过表达SIX2的小胶质细胞是否分泌携带特定miRNA的外来体，并且这些外来体是否能介导对共培养的多巴胺能神经元的保护作用？
本研究旨在阐明SIX2调节LPS诱导的小胶质细胞炎症损伤的分子和细胞机制，特别关注其在引导小胶质细胞从M1表型向M2表型极化中的作用。此外，我们试图确定SIX2介导的小胶质细胞极化是否导致分泌携带特定miRNA的外来体，以及这些外来体是否能赋予共培养的多巴胺能神经元神经保护作用。回答这个问题可能为SIX2在调节神经炎症中的作用提供新的见解，并为PD提供新的治疗策略。
2. 结果
2.1 SIX2调控BV2小胶质细胞极化并在LPS诱导的细胞毒性中保护多巴胺能细胞
SIX2在BV2小胶质细胞（BV2细胞）中的表达在LPS处理后以时间依赖性的方式显著增加超过2倍。来自新生SD大鼠的原代小胶质细胞的免疫荧光分析证实，超过98%的细胞为IBA1阳性（IBA1+），并且LPS处理后SIX2荧光强度显著增加。为了确定SIX2是否促进小胶质细胞从M1向M2极化，将BV2细胞转染shSIX2（敲低）或SIX2编码序列（过表达），并用LPS处理24小时。在敲低组中SIX2表达显著降低，在过表达组中SIX2表达增加。免疫荧光染色显示，LPS诱导的BV2细胞胞体增大，SIX2敲低进一步加剧了这种增大，而SIX2过表达则使其恢复到对照水平。在敲低组，M1标记物（TNF-α、IL-6、iNOS）的mRNA水平显著增加，而M2标记物（ARG-1、CD206、IL-10）则减少。相反，SIX2过表达逆转了这些效应。蛋白质分析证实，SIX2敲低增加了iNOS表达并降低了ARG-1表达，而过表达则有相反的效果。一致地，培养基的ELISA分析显示，SIX2敲低减少了IL-10的分泌并增加了IL-6的分泌，而过表达则效果相反。这些结果表明SIX2促进小胶质细胞从M1向M2极化。
由于LPS激活的小胶质细胞通过释放炎症因子损伤周围神经元，我们接下来研究了SIX2调控的小胶质细胞是否能保护神经元免受这种损伤。多巴胺能细胞系MES23.5（MES23.5细胞）在来自LPS处理的、SIX2敲低（BV2shSIX2 细胞）或过表达（BV2SIX2 细胞）的BV2细胞的24小时条件培养基中培养。MES23.5细胞的凋亡率在SIX2敲低组显著更高，而在过表达组则较低。这些发现表明，BV2细胞中SIX2过表达抑制了LPS诱导的细胞毒性，并保护了共培养的MES23.5细胞。
2.2 小胶质细胞中SIX2过表达促进LPS诱导的神经炎症小鼠中M1向M2的极化
使用AAV-SIX2-mcherry在小鼠黑质小胶质细胞中特异性过表达SIX2。免疫荧光证实小胶质细胞特异性标记物IBA1与mcherry标记的SIX2共定位。LPS处理增加了IBA1+细胞的数量，而SIX2过表达使其恢复到对照水平。LPS刺激也提高了中脑中TNF-α mRNA水平，这一效应被SIX2过表达消除。类似地，SIX2过表达逆转了LPS介导的CD206 mRNA水平下降。值得注意的是，与对照组相比，单独的LPS就诱导了CD206表达的适度增加，这可能反映了对内源性代偿或对炎症修复反应的启动。引人注目的是，SIX2过表达强烈地放大了这种反应，将CD206提升到显著高于仅LPS组的水平。使用TNF-α或CD206与IBA1的免疫荧光染色来量化活化小胶质细胞中的M1和M2小胶质细胞。与对照组相比，LPS处理组中TNF-α+小胶质细胞的比例显著更高，而CD206+小胶质细胞显著减少。正如预期的那样，SIX2过表达逆转了这些效应。这些结果表明，小胶质细胞中SIX2过表达促进了黑质中M1向M2的极化，并抑制了LPS诱导的神经炎症。
2.3 SIX2通过上调DDIT4促进LPS诱导的小胶质细胞M2极化
对LPS处理的BV2shSIX2 细胞进行RNA-seq分析显示，SIX2敲低上调了72个基因，下调了116个基因。使用ChIP-atlas筛选SIX2靶基因，并将结果与RNA-seq数据取交集，DDIT4被鉴定为一个关键的下游靶标。RT-qPCR进一步证实，DDIT4表达在LPS处理的BV2shSIX2 细胞中显著降低，但在LPS处理的BV2SIX2 细胞中上调。SIX2过表达也增加了BV2细胞中的DDIT4表达。ChIP-qPCR证实SIX2结合到DDIT4启动子的-901到-896 bp（P1）和-618到-603 bp（P2）区域，对P1的结合亲和力更强。双荧光素酶报告基因检测进一步证明，SIX2显著增强了LPS处理的BV2SIX2 细胞中DDIT4的转录活性。这些结果表明SIX2直接结合到DDIT4启动子，并在LPS处理的BV2细胞中上调其表达。
为了确定DDIT4在SIX2介导效应中的作用，使用siRNA沉默DDIT4。DDIT4沉默消除了SIX2抑制LPS诱导的BV2细胞胞体增大的能力。此外，SIX2过表达显著降低了LPS处理的BV2细胞中TNF-α和iNOS mRNA水平，同时增加了ARG-1 mRNA水平，这些效应被DDIT4沉默逆转。同样，DDIT4沉默消除了SIX2介导的iNOS和ARG-1蛋白表达的变化。CCK8检测显示，SIX2促进了LPS激活的BV2细胞的活力，这一效应被DDIT4沉默消除。TUNEL检测进一步证实了这些发现。
在原代小胶质细胞中观察到类似的结果。慢病毒介导的SIX2过表达增加了SIX2水平，而免疫荧光证实了SIX2过表达、LPS处理的小胶质细胞中DDIT4表达降低。DDIT4敲低逆转了SIX2介导的对小胶质细胞胞体大小的影响，以及iNOS和ARG-1的表达。总之，这些发现表明，SIX2通过上调DDIT4表达促进LPS诱导的小胶质细胞向M2极化。
2.4 SIX2/DDIT4信号通路通过抑制自噬促进BV2细胞的M2极化
DDIT4是mTOR的抑制剂，而mTOR是启动自噬的关键因子。由于自噬促进BV2细胞从M1向M2极化，我们假设DDIT4通过抑制mTOR磷酸化和激活自噬，促进LPS处理的BV2细胞中M1向M2极化。为了验证这一点，我们测量了LPS处理的BV2SIX2 细胞在有无DDIT4沉默情况下的mTOR磷酸化以及LC3II/I和P62的蛋白水平。使用晚期自噬抑制剂BafA1来阻断自噬体-溶酶体融合。DDIT4沉默显著增加了mTOR磷酸化和P62蛋白水平，同时降低了LC3II/I水平。为了评估DDIT4对自噬流的影响，用mRFP-GFP-LC3慢病毒转染BV2SIX2 细胞，并在LPS处理后，在有无DDIT4沉默的情况下测量自噬流。与对照组相比，DDIT4沉默降低了红色与黄色斑点（LC3指示剂）的比率，表明自噬流受到抑制。这些结果表明SIX2/DDIT4信号通路通过抑制mTOR磷酸化激活LPS处理的BV2细胞中的自噬。
接下来，在LPS处理的BV2细胞中过表达DDIT4，并使用3-MA抑制自噬。Western印迹和RT-qPCR证实了DDIT4过表达。DDIT4过表达抑制了LPS诱导的TNF-α mRNA水平，并增加了ARG-1 mRNA水平，这些效应被3-MA逆转。F-肌动蛋白免疫荧光染色显示，DDIT4过表达恢复了LPS诱导的BV2细胞胞体增大，这一效应被3-MA消除。同样，CCK8和TUNEL检测显示，DDIT4过表达改善了细胞活力并减少了LPS诱导的凋亡，这些效应被3-MA逆转。总之，这些结果表明DDIT4通过抑制mTOR磷酸化激活自噬，促进LPS处理的BV2细胞中M1向M2极化。
2.5 BV2SIX2 细胞通过外来体分泌保护MES23.5细胞
在中枢神经系统中，小胶质细胞将外来体分泌到细胞外环境，通过作用于神经元和其他胶质细胞来调节大脑结构和功能。我们接下来询问，通过SIX2过表达从M1极化为M2的BV2细胞是否能通过外来体分泌保护MES23.5细胞。免疫荧光染色显示，外来体抑制剂GW4869减少了LPS处理的BV2SIX2 细胞中的CD63+囊泡，表明外来体分泌减少。为了测试外来体的保护作用，将来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的培养基与MPP(+)处理的MES23.5细胞共培养。MPP(+)处理显著降低了MES23.5细胞中TH的表达，这一效应被SIX2过表达逆转，但被GW4869阻断。CCK8和TUNEL检测进一步证实，SIX2过表达改善了细胞活力并抑制了MPP(+)诱导的凋亡，这些效应被GW4869消除。
为了分离外来体，通过超速离心纯化来自LPS处理的BV2SIX2 细胞培养上清液。TEM显示了外来体典型的杯状形态，NTA显示囊泡直径为30-120 nm。Western印迹证实囊泡中高表达外来体标记物（CD9、TSG101、CD63），而高尔基体标记物GRASP65则不存在。这些结果表明，LPS处理的BV2细胞中SIX2过表达通过外来体分泌保护MES23.5细胞。
为了评估外来体摄取，将来自LPS处理的BV2SIX2 细胞上清液的囊泡与MES23.5细胞共培养24小时。PKH-26标记的外来体在鬼笔环肽染色的MES23.5细胞的细胞质中被观察到，证明了其内化作用。为了确定神经保护的最佳外来体浓度，用不同浓度的外来体处理MES23.5细胞。在10 μg/mL时，外来体显著增加了细胞活力，因此该浓度被用于后续实验。CCK8和TUNEL检测证实，来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体改善了MPP(+)处理的MES23.5细胞的细胞活力并减少了凋亡。这些结果表明，LPS处理的BV2SIX2 细胞分泌的外来体被MES23.5细胞摄取并发挥保护作用。
2.6 来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体miR-3470b保护MES23.5细胞免受MPP(+)损伤
外来体以其独特的膜结构保护内部RNA免受降解，并作为细胞间miRNA转移的关键载体。为了确定来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体是否通过miRNA转移保护MES23.5细胞，使用siRNA沉默了BV2细胞中关键的miRNA合成酶DROSHA。选择效率最高的siRNA用于进一步研究。从这些BV2细胞中分离的外来体被应用于MPP(+)处理的MES23.5细胞。与来自对照BV2细胞的外来体相比，来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体显著增加了MES23.5细胞中TH蛋白表达，这一效应被DROSHA沉默逆转。
与这些发现一致，TUNEL检测显示，SIX2过表达对MPP(+)诱导的MES23.5细胞损伤的保护作用被DROSHA敲低消除。这些结果强烈表明，来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体通过miRNA转移对MES23.5细胞发挥保护作用。为了识别介导这种保护作用的具体miRNA，对来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体进行了miRNA测序。在差异表达的miRNA中，miR-3470b显著上调，并通过RT-qPCR验证。将这些外来体应用于MPP(+)处理的MES23.5细胞，与对照组相比，miR-3470b表达显著增加，而单独的MPP(+)处理并未改变miR-3470b水平。这表明MES23.5细胞中增加的miR-3470b源自外来体转移，而非内源性上调。
为了进一步验证外来体miR-3470b的作用，使用sh-miR-3470b病毒敲低BV2SIX2 细胞中的miR-3470b。在LPS处理后，收集来自miR-3470b敲低的BV2SIX2 细胞的外来体，并将其应用于MPP(+)处理的MES23.5细胞。这些外来体显著降低了MES23.5细胞中的TH表达并增加了凋亡。总之，这些结果表明，来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体转移miR-3470b，保护MES23.5细胞免受MPP(+)诱导的损伤。
2.7 外来体miR-3470b通过靶向GREM1保护MES23.5细胞免受MPP(+)诱导的损伤
使用miRWalk和TargetScan软件，我们鉴定了miR-3470b在MES23.5细胞中的下游靶基因。维恩分析揭示了前6个潜在靶点。RT-qPCR证实，来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体显著降低了MES23.5细胞中FXYD5、GREM1和SPCS3的表达。考虑到GREM1与细胞存活的显著相关性，我们选择GREM1进行进一步研究。为了确定miR-3470b是否靶向MES23.5细胞中的GREM1，我们使用TargetScan软件预测了GREM1 3′-UTR内的一个结合位点（CAGAGTGA）。构建了包含野生型或突变型（ACTCTGTC）结合位点的质粒，并与辅助质粒共转染到MES23.5细胞中。GREM1 3′-UTR中miR-3470b结合位点（CAGAGTGA到ACTCTGTC）的突变显著降低了荧光素酶活性，证实GREM1是miR-3470b在MES23.5细胞中的直接靶标。
为了进一步验证这些发现，使用sh-GREM1慢病毒敲低MES23.5细胞中的GREM1，并选择最有效的慢病毒。然后，敲低LPS处理的BV2SIX2 细胞中的miR-3470b，并将来自这些细胞的外来体应用于感染了sh-GREM1慢病毒并用MPP(+)处理的MES23.5细胞。与来自miR-3470b敲低BV2细胞的外来体相比，来自同时敲低miR-3470b和GREM1的细胞的外来体显著增加了MES23.5细胞中TH的表达和下TGF-β信号传导。TUNEL检测也显示同时敲低组的凋亡减少。这些结果表明，来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体miR-3470b通过抑制GREM1并激活TGF-β信号通路，保护MES23.5细胞免受MPP(+)诱导的损伤。
2.8 外来体miR-3470b通过GREM1保护帕金森病模型中的中脑多巴胺能神经元
为了在体内验证来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体miR-3470b通过下调GREM1保护多巴胺能神经元，将sh-GREM1慢病毒注射到小鼠的SNpc。一周后，静脉注射两种类型的外来体：来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体（Exo）和来自miR-3470b敲低的BV2SIX2 细胞的外来体（miR-3470bKD -Exo）。同时，腹腔注射MPTP以诱导急性PD模型。为了评估外来体递送效率，免疫荧光染色证实，静脉注射的外来体成功地靶向并进入了中脑多巴胺能神经元。
对SNpc的进一步分析显示，与对照组相比，MPTP组中TH+多巴胺能神经元显著减少。外来体给药（Exo组）显著增加了相对于MPTP组的TH+神经元数量。然而，miR-3470b敲低（miR-3470bKD -Exo）显著降低了与Exo组相比的TH+神经元数量。值得注意的是，同时敲低miR-3470b和GREM1，将TH+神经元数量恢复到高于仅敲低miR-3470b组的水平。相反，SNpc中IBA1+小胶质细胞的数量呈现出相反的模式，表明小胶质细胞激活与多巴胺能神经元健康之间存在联系。
Western印迹分析显示，外来体注射逆转了MPTP诱导的TH和TGF-β下调，同时促进了GREM1的过表达。这种保护作用被miR-3470b敲低消除，但被同时敲低GREM1所恢复。行为测试，包括旋转棒测试和爬杆测试，进一步证实外来体miR-3470b减轻了MPTP诱导的损伤，这一效应依赖于GREM1的抑制。总之，这些发现表明，来自LPS处理的BV2SIX2 细胞的外来体miR-3470b浸润多巴胺能神经元，抑制GREM1表达，并保护其免受MPTP诱导的损伤。
3. 讨论
我们的研究阐明了SIX2在调节与帕金森病相关的神经炎症中的关键过程——小胶质细胞极化中的关键作用。具体而言，我们证明了小胶质细胞中SIX2过表达促进其向抗炎的M2表型极化，这对于多巴胺能细胞保护至关重要。通过一系列体外和体内实验，我们确定了这种保护效应背后的新分子机制。首先，我们发现SIX2通过结合其启动子区域直接上调DDIT4表达，导致mTOR信号传导抑制和随后的自噬激活。这种自噬诱导促进了小胶质细胞从促炎的M1表型向神经保护性M2表型的转变。此外，我们发现M2极化的小胶质细胞分泌含有miR-3470b的外来体，这些外来体被多巴胺能细胞摄取。在这些细胞内，miR-3470b靶向GREM1/TGF-β信号通路，从而发挥显著的神经保护作用。这些发现不仅突出了SIX2在调节小胶质细胞极化和神经元存活中的双重作用，也为靶向SIX2-DDIT4-miR-3470b轴在PD中的治疗潜力提供了新见解。
调节小胶质细胞表型从M1向M2的转变是中枢神经系统修复的一种有前景的治疗策略。在本研究中，我们证明了转录因子SIX2在这一过程中起着重要作用。我们观察到内源性SIX2表达在小胶质细胞LPS处理后增加，并且SIX2水平升高促进了小胶质细胞向M2表型极化，从而抑制了LPS诱导的神经炎症并保护多巴胺能细胞。为了进一步验证SIX2的作用，我们使用AAV-DIO-SIX2在Cx3cr1-CreERT2小鼠的小胶质细胞中特异性过表达SIX2。这种过表达也促进了LPS诱导的小鼠模型中SNpc的M2极化。这些发现表明，SIX2作为一种内源性保护因子，通过应激诱导的上调来对抗外部应激源的损伤。这与我们早期的发现一致，即小胶质细胞中的SIX2抑制LPS诱导的神经炎症。重要的是，在同一研究中，我们提供了直接的组织学证据，证明小胶质细胞特异性SIX2过表达保护黑质多巴胺能神经元免受LPS诱导的损失，这是通过酪氨酸羟化酶（TH）染色评估的。另一项研究报告称，LPS处理的巨噬细胞中SIX2的重新表达通过抑制非经典NF-κB信号通路表现出强大的抗炎作用。总之，这些发现强化了SIX2是神经保护和炎症调节的关键因素这一观点。
为了阐明SIX2促进小胶质细胞向M2表型极化的机制，我们进行了RNA-Seq分析与ChIP-Atlas在线分析相结合。我们的发现表明，SIX2正向调节DDIT4 mRNA水平。DDIT4是一种应激诱导蛋白，调节细胞代谢和炎症。重要的是，DDIT4已被证明通过调节氧化应激和促进代谢重编程来抑制炎症反应。在我们的研究中，我们证明了SIX2通过结合到Ddit4启动子的-901 bp到-886 bp区域上调DDIT4表达。这种DDIT4的上调是促进小胶质细胞向M2表型极化并最终保护多巴胺能细胞免受炎症损伤的关键步骤。
DDIT4是mTOR的公认内源性抑制剂，而mTOR是细胞自噬的关键调节因子。自噬在抑制神经炎症反应中起着关键作用，其在小胶质细胞中的损害通过NLRP3炎性小体激活加剧神经炎症，导致PD模型中的运动和认知缺陷。LPS和α-突触核蛋白等药物抑制自噬，驱动小胶质细胞向促炎M1表型发展，并加剧神经变性。相反，增强自噬促进M2极化和神经元修复。值得注意的是，DDIT4已被证明通过促进自噬来增强巨噬细胞代谢重编程，从而保护免受免疫驱动病理如非酒精性脂肪肝病和结肠炎症的侵害。在我们的研究中，我们证实DDIT4抑制mTOR活性，导致自噬激活。这种自噬激活促进小胶质细胞向M2表型极化，最终保护共培养的多巴胺能细胞。这些发现表明SIX2通过DDIT4/mTOR/自噬轴调节小胶质细胞极化，为其神经保护作用提供了机制基础。
随后，我们研究了由SIX2过表达诱导的M2极化小胶质细胞保护多巴胺能细胞的机制。以外来体作为细胞间通讯的关键介质为重点，我们发现来自SIX2过表达小胶质细胞的外来体在这一过程中起着关键作用。具体而言，miR-3470b被鉴定为这些外来体中显著上调的miRNA，并且我们证明了其促 进 多 巴 胺 能
打赏
