摘要
随着水产养殖业的快速发展，大西洋鲑鱼已成为全球集约化养殖的主要食用鱼类之一。肠道微生物群在鱼类健康和性能中扮演重要角色，但对鲑鱼苗期肠道菌群功能潜力的认识仍然有限。本研究从鲑鱼苗肠道内容物中分离并基因型表征了11株细菌。利用长读长纳米孔技术进行全基因组测序和功能注释，揭示了这些菌株广泛的代谢多样性，包括一系列碳水化合物活性酶（CAZymes）、蛋白酶、脂肪酶以及（多）酚降解酶，这些酶可能共同参与饲料来源成分的代谢。此外，所有分离株都具备产生有益代谢物的基因组潜力，包括短链脂肪酸（SCFAs）乙酸盐和丙酸盐，以及多种B族维生素和维生素K2。研究还发现了编码细菌素和其他次级代谢物的基因，表明它们具有对抗肠道病原体的生态位竞争力。在分离株中，进一步研究发现Lactococcus raffinolactisASF-5具有选择性去除植物性饲料中难消化寡糖的潜力。该菌株能在棉子糖（一种对鲑鱼具有抗营养作用的寡糖）上生长。通过AlphaFold 3模型分析，证实这种能力得益于一个GH36家族α-半乳糖苷酶和两个GH32家族蔗糖酶，它们可以协同作用完全水解棉子糖。最后，L. raffinolactisASF-5作为饲料添加剂表现出良好的安全性，对所有测试的抗生素均敏感，且无溶血活性。
引言
脊椎动物胃肠道（GIT）中的微生物群落与宿主的多种性状和功能密切相关。尽管在人类和其他陆生哺乳动物中已有深入研究，但鱼类的肠道微生物群受到的关注要少得多。随着鲑鱼养殖的集约化以满足对高蛋白食品日益增长的需求，针对这种鱼类肠道微生物群的研究正在迅速推进。然而，迄今为止的大多数研究主要集中于分类学分析，描述了饮食如何影响鲑鱼肠道微生物群的多样性和组成，对这些微生物群落的功能潜力仍知之甚少。了解微生物如何定植于鲑鱼胃肠道、促进饲料成分分解、提高养分可用性并为宿主产生有益代谢物，为以更可持续和高效的方式优化水产养殖生产系统提供了令人兴奋的机遇。
基于扩增子测序的大量研究已经描述了大西洋鲑鱼肠道微生物群组成受饮食、环境条件、地理位置和病原体暴露驱动的差异。在幼鲑和成鲑中，主要的微生物门是假单胞菌门（原变形菌门），以及芽孢杆菌门（原厚壁菌门）和支原体门（原柔膜菌门）。虽然认为在非幼体阶段更为稳定，但鱼苗的肠道微生物群更具动态性和可变性，通常受养殖水微生物群的影响，并以个体间高度变异为特征。
尽管测序研究增进了我们对鲑鱼肠道微生物群的了解，但对该生态系统中细菌的培养仍属零星，主要集中于病原体和一些通过16S rRNA基因测序鉴定的共生菌。这限制了物种或菌株水平的分辨率，并对鱼类不同发育阶段肠道细菌的功能潜力提供了有限的见解。最近，基于培养的方法与先进的全基因组测序技术相结合，催生了“鲑鱼微生物基因组图谱”，这是一个来自幼鲑和成年大西洋鲑鱼的211个细菌分离株的培养集合，其完整基因组序列已公开。相比之下，来自鲑鱼苗的肠道分离株仍然稀少。
全球对鲑鱼需求的增长加强了对可持续饲料原料以替代鱼粉的需求，这由于对有限海洋资源的依赖而带来了生态和经济挑战。植物蛋白因其成本效益和使用陆生动物副产品带来的负面消费者感知，已成为最广泛使用的替代品。然而，当鲑鱼饲料含有大量植物蛋白以满足必需营养需求时，鱼的生长性能通常不如鱼粉饲料。事实上，植物性饲料中的许多营养物质被包裹在复杂的碳水化合物基质中，形成了物理屏障，限制了鲑鱼消化蛋白酶的作用，从而降低了蛋白质消化和氨基酸吸收的效率。养分同化需要通过内源性或微生物酶将其分解为可吸收单位。在鲑鱼中，仅靠内源性酶通常不足，因此需要添加酶补充剂以提高富含碳水化合物的饲料的可消化性。植物性饲料原料的酶预处理已被证明可以通过去除抗营养因子（包括抗原蛋白、难消化寡糖和水杨酸）来提高消化率和鱼类生长。值得注意的是，饲料加工策略，例如使用芽孢杆菌属和乳球菌属进行细菌发酵，或施用源自鲑鱼肠道、代谢能力与特定植物蛋白来源碳水化合物含量相匹配的有益细菌，可以同时提供可能有助于鱼类营养的酶和代谢物，同时增加对病原体和疾病的抵抗力，从而促进鲑鱼健康和经济可持续性。
在这项工作中，我们对从鲑鱼苗胃肠道中分离得到的一组细菌进行了基因型表征，以评估它们对鱼类营养和健康的贡献能力。
材料与方法
细菌分离与培养条件
菌株从商业养殖场的健康大西洋鲑鱼苗肠道中分离。样品收集自同一养殖场内三个不同的水产养殖单元，代表不同年龄。对于5克以下的鱼苗，解剖整个胃肠道，对于较大的鱼苗，轻轻挤出后肠内容物。样品在MRD中连续稀释后，涂布于不同琼脂平板上，在好氧或厌氧条件下室温培养。挑取单菌落，通过16S rRNA基因全长扩增和测序进行初步分类。
细菌基因组测序与组装
使用纳米孔技术进行全基因组测序。文库制备后，在MinION设备上测序。原始读数经过质量过滤，使用多种组装工具进行组装，并进行抛光。使用CheckM2评估组装质量，并使用dRep对菌株水平进行去冗余。
基因组分类学与功能注释
使用GTDB-Tk为所有基因组分配分类。使用DRAM获得功能注释。使用内部脚本评估基因组中编码B族维生素生产酶的基因存在情况。使用ResFinder注释导致抗菌素耐药性的基因或染色体突变。使用Bagel4进行细菌素预测。使用antiSMASH预测参与次级代谢物生产的生物合成基因簇。
系统发育分析
使用GTDB-Tk获得的120个普遍存在的单拷贝蛋白的串联比对来推断本研究中获得的菌株之间的系统发育关系。使用IQ-Tree构建最大似然系统发育树。
病毒重叠群预测
使用VirSorter2处理基因组，以识别病毒核苷酸特征。使用CheckV评估预测的前噬菌体区域的完整性。使用DRAM-v注释病毒序列。
16S rRNA基因与公开可用的扩增子数据集的比对
从NCBI BioProject下载大西洋鲑鱼肠道样品的16S rRNA扩增子数据集。使用DADA2流程进行读数降噪、合并和嵌合序列筛选，获得每个BioProject的扩增子序列变异（ASV）。将从11个基因组中提取的16S rRNA基因序列与所有扩增子数据集的ASV进行比对。
L. raffinolactisASF-5的比较基因组分析
从NCBI下载42个公开菌株的基因组序列用于比较基因组分析。使用基于120个普遍单拷贝蛋白的串联比对构建系统发育树。
抗生素敏感性测试和溶血活性
使用琼脂圆片扩散法评估L. raffinolactisASF-5的抗生素敏感性。在TSA平板上均匀涂布细菌接种物，应用抗生素圆片，孵育后测量抑菌圈直径。使用血琼脂平板测定溶血活性。
在棉子糖上的生长实验
在96孔微孔板中进行以单一碳水化合物为唯一碳源的生长实验。细菌在补充葡萄糖的MRS基础培养基中预培养过夜，然后接种到补充棉子糖的MRS基础培养基中。使用酶标仪测量600 nm处的光密度（OD600）以评估生长。
LrGH32和LrGH36拓扑结构的预测模型
使用AlphaFold 3对L. raffinolactisASF-5的两个糖苷水解酶（GH）家族32（GH32）蔗糖酶和一个α-半乳糖苷酶GH36进行单独建模。使用AlphaFold 3的配体共折叠工作流程，为每个酶-配体复合物生成了10个独立的配体结合构象。
结果与讨论
从鲑鱼苗肠道中回收的细菌分离株的一般基因组特征
微生物培养对于分离细菌菌株仍然不可或缺，并为纳入培养集合提供了分离株来源。这些工作继续使得将微生物基因型与表型联系起来成为可能，支持预测功能的实验验证，最终增进我们对肠道细菌如何影响宿主代谢和生理的理解。
为了扩大源自鲑鱼苗的肠道分离株库，我们最初从20条鱼的肠道内容物中获得了总共24个分离株。基于16S rRNA基因测序初步鉴定后，我们使用长读长牛津纳米孔技术进行了全基因组测序。经过处理和去冗余后，最终数据集包含11个独特的基因组。基因组组装在所有情况下都产生了环状染色体。在九个基因组中，组装由2-4个重叠群组成，包括一个染色体和一个到三个质粒序列。使用基因组分类数据库工具包（GTDB-tk）进行的分类学分类显示，大多数基因组隶属于放线菌目和乳杆菌目，其次是肠杆菌目、芽孢杆菌目、黄杆菌目和分枝杆菌目。基因组大小范围从放线菌目的3.78到4.1 Mb，乳杆菌目的2.4到3.6 Mb，肠杆菌目的4.2到4.8 Mb。Rhodococcussp. ASF-10具有最大的基因组，大小为5.9 Mb。观察到的分离株基因组大小在其各自分类群的预期范围内。基因组大小的差异反映在预测基因的数量上，L. raffinolactisASF-5的基因数最少，Rhodococcussp. ASF-10最多，分别为2,470和5,538个预测基因。值得注意的是，两个分离株代表了先前未在Halpernia和Brachybacterium属中报道过的物种。
P. marinus subsp. marinusstr. CCMP1375的基因组作为外群。树分支上的不同颜色描绘了基因组分类学目。带灰色阴影的热图显示每个基因组的重叠群总数。显示在热图旁边的水平条形图描绘了基因组质量（红色条形表示污染，绿色条形表示完整性）和基因组大小（蓝色条形）。">
在公开可用的16S rRNA扩增子测序研究中检测细菌分离株
接下来，我们探讨了这11个细菌分离株是否可以在鲑鱼不同发育阶段和生活史的肠道微生物组中被检测到。由于长读长DNA测序确保了所有基因组都编码全长16S rRNA基因，我们利用这一特性来探测它们在大量表征鲑鱼肠道微生物组研究的扩增子数据集中的存在。
在97%同一性截断值下，将本研究中11个细菌分离株的16S rRNA基因序列与来自14项先前研究的ASV进行比较，结果显示所有分离株都存在于源自幼鲑和成鲑的肠道微生物组数据集中。这11种细菌不仅在挪威鲑鱼微生物组中被检测到，也在来自苏格兰、英国和智利的野生和养殖大西洋鲑鱼的肠道样本中被发现。
从鲑鱼苗肠道来源的细菌基因组中编码的预测代谢功能
使用功能注释数据库，我们接下来探索了每个分离细菌菌株的代谢潜力。正如预期，核心代谢途径（例如糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环）在11个菌株中基本相似。所有菌株都呈现出可能导致鲑鱼肠道中有益代谢物的基因和途径，例如短链脂肪酸乙酸盐（所有菌株）和有机酸乳酸盐（除Oceanobacillus caeniASF-9外的所有菌株）。Carnobacterium maltaromaticumASF-1和Hafnia paralveiASF-7显示出生产丙酸盐的潜力。氮循环在11个基因组中各不相同。
膳食碳水化合物利用的潜力
不断发展的水产养殖实践要求探索新的饲料成分，作为传统鱼饲料的可持续替代品。了解鲑鱼苗肠道微生物如何代谢海洋、植物和昆虫来源的碳水化合物，可以指导优化营养和健康的新策略。为了确定11个分离株利用饲料来源碳水化合物的能力，我们研究了CAZyme家族库，特别是糖苷水解酶（GHs）、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶（PL）和辅助活性酶（AA）的存在。
大多数基因组平均含有81个编码CAZymes的基因。CAZymes数量最多的基因组是Rhodococcussp. ASF-10（CAZymes数量=127），这与同一属成员之前的研究一致，表明该细菌可能对鲑鱼肠道中膳食成分的代谢有实质性贡献。11种细菌中占主导地位的CAZyme家族是GH13，已被证明具有代谢淀粉的能力，其次是用于甘露、木寡糖和纤维寡糖解聚的GH1和GH3。还检测到用于半纤维素（木聚糖，GH10；甘露聚糖，GH26；阿拉伯聚糖，GH43和GH51）、几丁质（GH18、GH19和GH20）、黏蛋白（GH95）和藻类多糖（用于琼脂糖、昆布多糖和藻酸盐的GH16和PL6）解聚的CAZymes。
利用膳食脂质、蛋白质及其衍生物的潜力
考虑到鱼类饲料富含脂质和蛋白质的特性，我们研究了能够处理这些关键营养物质的细菌酶。九个细菌的基因组（Enterococcus italicusASF-8和L. raffinolactisASF-5除外）含有编码分泌型蛋白酶和外肽酶的基因，用于降解蛋白质和短肽链，表明在肠道环境中有一定程度的微生物蛋白质分解。七个基因组中检测到编码潜在分泌型脂肪酶和酯酶的基因（M. phyllosphaerae ASF-3、C. maltaromaticumASF-1、O. caeniASF-9和E. italicusASF-8除外），表明11个细菌分离株中的大多数可能在利用饲料来源的脂质和脂肪酸方面发挥作用。除C. maltaromaticumASF-1、E. italicusASF-8和L. raffinolactisASF-5外，所有细菌都可以通过β-氧化途径进行中链和短链脂肪酸的分解以产生乙酰辅酶A。这与之前的研究一致，表明乳杆菌目缺乏代谢外源脂质的能力，仅依赖它们进行膜合成。总的来说，这些发现表明，几种肠道细菌分离株具有可能有助于脂质、蛋白质及其短链衍生物消化的酶活性，这与它们可以增强鲑鱼苗的养分可用性或提供其代谢活动产生的有益化合物的观点一致。
利用多酚和芳香族化合物的潜力
膳食多酚和黄酮类化合物是植物中存在的天然化合物。研究表明，膳食多酚可以调节人类肠道微生物群落的组成，反过来，肠道微生物能够分解代谢多酚并释放具有生物活性的代谢物。这些代谢物与健康促进作用相关，包括抗氧化、抗炎和抗菌特性。虽然植物酚类化合物可能存在于鱼类饲料中，并且经常作为饲料添加剂进行研究以提高循环水养殖系统中饲养的鱼类的生长和健康，但微生物多酚代谢在鲑鱼肠道微生物组研究中从未被探索过。
为了鉴定11个细菌分离株中聚合、单体和简单酚的潜在转化途径，我们使用CAMPER注释了它们的基因组。所有分离株（M. phyllosphaerae ASF-3除外）都具有编码阿魏酸酯酶的基因，这些酶作用于阿魏酰化多糖，如阿拉伯木聚糖和果胶。Rhodococcussp. ASF-10显示出最广泛的多酚代谢能力，包括降解黄酮类化合物（槲皮素）、与多酚代谢相关的芳香族化合物（苯乙酸盐、苯丙酸盐、反式肉桂酸盐和对羟基苯基）以及香兰素衍生物的途径。两种Microbacterium属细菌显示出降解苯乙酸盐和槲皮素的潜力，而槲皮素降解酶也在H. paralveiASF-7、HalperniaASF-11和Proteussp. ASF-4的基因组中观察到。HalperniaASF-11显示出将对羟基苯基转化为尿黑酸的潜力。相反，C. maltaromaticumASF-1和E. italicusASF-8没有显示出利用多酚的潜力。总的来说，我们的数据揭示了鲑鱼苗肠道中潜在的微生物组-多酚相互作用图景，强调了多酚、黄酮类化合物和香兰素衍生物作为可能影响微生物活动和宿主代谢的底物的作用，尽管历史上一直被忽视。
维生素生产的预测能力
B族和K2维生素是微量营养素，可作为参与多种代谢和调节过程的必需辅因子的前体，使它们对宿主及其常驻肠道微生物群都至关重要。野生鲑科鱼类对硫胺素（B1）缺乏高度敏感，这已被认为是北半球种群下降的一个因素。在养殖鱼类中，核黄素、烟酸、吡哆醇、钴胺素、叶酸和维生素K等其他维生素的缺乏会损害生长、发育和整体健康。此外，研究表明，当饲喂富含植物成分的新型饲料时，鲑鱼需要更高水平的B族维生素。尽管肠道微生物群已知可以向其宿主提供维生素K和B族维生素，如在人类和反刍动物中所显示的那样，但它们对鲑鱼维生素供应的潜在贡献很少（如果有的话）受到关注。鉴于补充剂的高成本，增强肠道微生物群的维生素生物合成能力并减少外源性维生素供应需求的策略对于降低水产养殖生产成本至关重要。
为了评估本研究中11个细菌分离株的维生素生物合成潜力，我们开发了一个内部脚本，涵盖了通过全面文献调查编制的参与维生素B和K生物合成的121种酶（EC编号）。在所有11个分离株中都检测到K和B族维生素生物合成潜力。具体来说，H. paralveiASF-7和Proteussp. ASF-4具有生产硫胺素的基因组潜力。核黄素可以由Microbacteriumsp. ASF-2、M. phyllosphaeraeASF-3、H. paralveiASF-7、Proteussp. ASF-4和HalperniaASF-11合成。BrachybacteriumASF-6、Microbacteriumsp. ASF-2、M. phyllosphaeraeASF-3、H. paralveiASF-7、L. raffinolactisASF-5和Rhodococcussp. ASF-10可以生产烟酸，而吡哆醇和生物素的生产似乎是H. paralveiASF-7和Proteussp. ASF-4的专属能力。泛酸、叶酸和甲萘醌（维生素K）生物合成途径存在于BrachybacteriumASF-6、Microbacteriumsp. ASF-2、M. phyllosphaeraeASF-3、H. paralveiASF-7和Rhodococcussp. ASF-10的基因组中。钴胺素生物合成潜力仅在Rhodococcussp. ASF-10的基因组中检测到。最后，O. caeniASF-9仅显示出叶酸和甲萘醌的生物合成代谢潜力。我们的结果表明，具有互补维生素生物合成潜力的微生物物种存在于鲑鱼苗的肠道中，这表明相互作用可能涉及维生素、其中间体及相关代谢物在整个微生物群落中的交换。此外，当可能通过细胞裂解释放到细胞外时，有可能向鲑鱼宿主提供维生素供应，正如先前对鲑科相关支原体所推测的那样。
次级代谢物生产的预测能力
次级代谢物，如细菌素、聚酮化合物、非核糖体肽、萜类、铁载体或抗生素，是介导肠道微生物之间竞争和合作的生物活性化合物。特别是，它们增强了生态位竞争力并抑制肠道病原体，这是益生菌的标志性特征。我们使用antiSMASH和BAGEL4来识别我们11个细菌基因组中推定的次级代谢物生物合成基因簇。
对于细菌素，在RhodococcusASF-10和C. maltaromaticumASF-1的基因组中鉴定出编码Sactipeptide的基因；细菌素Zoocin_A在E. italicusASF-8中；而Colicin_E6、Alveicin_B_Bacteriocintoxin和Bottromycin的生产在Proteussp. ASF-4中被预测；Lanthipeptide_class_II和Carnobacterium_MB1在C. maltaromaticumASF-1中；以及Lactococcin_972在L. raffinolactisASF-5中。
检测到几种不同次级代谢物生物合成的基因簇。萜类前体和3型聚酮合酶是分布最广泛的基因簇，几乎所有基因组至少有一个。在M. phyllosphaeraeASF-3、H. paralveiASF-7、Proteussp. ASF-4、E. italicusASF-8和Rhodococcussp. ASF-10中检测到具有抗菌或群体感应作用的β-内酯和RiPP样（核糖体合成和翻译后修饰肽）化合物的生产簇。在BrachybacteriumASF-6、O. caeniASF-9和Rhodococcussp. ASF-10中鉴定出四氢嘧啶生物合成簇，表明这些分离株具有渗透保护机制，并适应高盐度环境。类似地，Ni-铁载体簇的存在表明Microbacteriumsp. ASF-2和H. paralveiASF-7具有这种能力。在BrachybacteriumASF-6中检测到编码Bottromycin（一种
