一种促进牙髓干细胞成骨分化及生物矿化形成的胶原-纤维支架的结构分析

临床研究显示胶原蛋白基支架与血液结合可增强根管内矿化，但机制不明确。本研究通过体外胶原蛋白-纤维蛋白复合水凝胶模型，发现复合结构较单一成分具有更高的力学模量和独特的纤维-矿化复合网络，显著促进牙髓干细胞成骨分化，并形成与天然骨结晶度相当的羟基磷灰石结构。

罗宇婷|史富|崔慕云|冯宽哲|黄罗伯特|汉森亚当|扎利兹尼亚克塔蒂亚娜|斯普罗斯特大卫|克莱因曼奥尔加|辛格古尔泰杰|西默曼杰罗姆|西蒙玛西娅|拉法伊洛维奇米里亚姆

美国纽约州石溪大学材料科学与化学工程系，邮编11794

摘要

目的

临床再生性根管治疗（RET）的研究表明，当基于胶原蛋白的支架与血液结合使用时，可以促进根管内的矿化作用，但其背后的机制尚不清楚。本研究使用了一个简化的体外胶原蛋白-纤维蛋白模型，将纤维蛋白（血液中的关键成分）整合到胶原蛋白中，比较了胶原蛋白-纤维蛋白支架的结构、化学和机械性能，并将其与牙髓干细胞（DPSCs）的成骨分化和生物矿化过程进行了关联。

方法

通过拉曼光谱、冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM）、原子力显微镜（AFM）和振荡剪切流变学方法制备并表征了胶原蛋白、纤维蛋白及胶原蛋白-纤维蛋白水凝胶。在不含地塞米松的条件下，将牙髓干细胞（DPSCs）培养在这些支架上长达28天，以分离支架的促进作用。通过qRT-PCR、拉曼光谱、阿利扎林红S（ARS）染色和SEM-EDX技术评估了成骨分化和矿化过程。

结果

与单独的水凝胶相比，胶原蛋白-纤维蛋白支架形成了具有更高模量的复合网络，并具有独特的微观结构。培养在胶原蛋白-纤维蛋白支架上的DPSCs表现出更强的成骨分化能力，包括骨钙素和骨唾液蛋白的表达增加。虽然所有支架上都形成了磷酸钙，但胶原蛋白-纤维蛋白复合材料独特地支持了具有与天然骨骼相似结晶度的纤维相关羟基磷灰石的形成。

意义

胶原蛋白-纤维蛋白水凝胶提供了一种机械增强的、模拟细胞外环境的支架，能够促进牙髓干细胞的生物调控矿化过程。该模型为RET过程中观察到的硬组织形成提供了机制上的见解，并强调了纤维蛋白在矿化组织形成中的关键作用，尤其是在出血受限的情况下具有临床应用价值。

引言

再生性根管治疗（RET）是一种基于生物学的方法，旨在恢复牙齿内部的牙髓-牙本质复合结构[1]。这种治疗方法主要用于牙髓坏死和根尖发育不完全的未成熟牙齿[2]。成功的RET主要依赖于干细胞的可用性（如牙髓干细胞（DPSCs）和顶端乳头干细胞（SCAP）以及能够支持细胞分化和组织再生的适当支架[3],[4]。

已经探索了多种用于RET的支架系统，包括血块、富血小板血浆和富血小板纤维蛋白[5],[6],[7]。最近，一种基于胶原蛋白的复合支架SynOss™ Putty（Collagen Matrix Inc，美国新泽西州奥克兰）被引入临床，用于治疗患有根尖牙周炎的未成熟牙齿[8]。该支架由牛I型胶原蛋白与磷酸钙基矿物颗粒组成。在诱导出血后，将SynOss Putty放入根管中。放射学检查显示，当SynOss Putty与血块一起使用时，根管内形成了矿化组织。长期临床病例报告了在未成熟牙齿中使用SynOss Putty与血块结合进行RET的效果[9]。首先在根管内诱导出血，然后放置SynOss Putty。平均进行了55个月的随访临床检查以评估根管空间的矿化情况。随访放射学结果显示，所有病例的根尖病变均得到解决，根管内形成了部分或完全矿化的组织。此外，所有牙齿均保持功能正常且无症状，根尖也闭合。

一项更全面的临床研究调查了SynOss Putty在治疗未成熟牙齿时的效果，包括有无血块的情况[10]。研究中测试了三种支架：单独使用SynOss Putty、单独使用血块以及SynOss Putty + 血块。组织学结果显示，在使用SynOss Putty + 血块处理的牙齿中，根管空间和牙本质壁上形成了矿化组织及类似牙骨质的组织。相比之下，单独使用SynOss Putty处理的牙齿未能实现适当的组织愈合，反而形成了根尖病变。这些发现表明，SynOss Putty与血块的结合促进了未成熟坏死牙齿根管内的矿化组织形成。

尽管在临床上观察到了成功的RET效果，但当血块与SynOss Putty一起使用时，导致矿化组织形成的具体机制仍不清楚。SynOss Putty主要由I型胶原蛋白组成，这是细胞外基质中最丰富的结构蛋白，它提供了机械支撑，并传递对细胞粘附、迁移和组织再生至关重要的生物信号[11],[12]。同时，RET过程中诱导的血块作为一种富含纤维蛋白等蛋白质的天然支架，有助于细胞迁移和组织重塑[13],[14]。虽然胶原蛋白和纤维蛋白单独都能支持再生，但目前尚不清楚它们的组合是否产生了促进矿化的新特性。

因此，我们假设临床上观察到的矿化组织形成是胶原蛋白和纤维蛋白之间协同作用的结果，形成了具有比单一成分更有效的促进矿化的复合蛋白质基质。为了了解这些因素中哪个是协同效应的主要驱动因素，我们设计了一个简化的体外模型，使用来自SynOss Putty的主要成分胶原蛋白、血液的主要成分纤维蛋白以及这两种蛋白质的混合物作为支架。作为生物探针，使用了未经外源性成骨或牙源性诱导因子处理的牙髓干细胞来评估这些基质启动干细胞分化和矿化的能力。通过机械、微观结构和化学表征技术来确定混合胶原蛋白和纤维蛋白是否引入了与增强生物矿化相关的独特材料特性。

SynOss悬浮液和SynOss-纤维蛋白水凝胶的制备

从Collagen Matrix Inc购买SynOss™ Putty（MB050批次SMBN18J2），并使用手术刀片将其切割成小颗粒以制备悬浮液和纤维蛋白水凝胶。在Dulbecco’s alpha Minimal Essential Medium（Gibco，美国沃尔瑟姆）中制备了浓度为14 mg/mL的SynOss Putty悬浮液。通过将SynOss颗粒与纤维蛋白原混合并在接种前加入凝血酶，制备了浓度为14 mg/mL的SynOss（含4 mg/mL纤维蛋白原和3 U/mL凝血酶）- 纤维蛋白水凝胶。

SynOss Putty的表征

通过微CT（图1A）观察到了SynOss Putty的整体3D形态，显示出由矿物质聚集而成的致密异质结构与纤维网络交织在一起。颜色映射显示密集区域为绿色，较不密集的纤维区域为蓝色。使用cryo-SEM结合EDX映射分析了SynOss Putty的微观结构（图1B-C），图像显示了胶原纤维基质中散布着矿物质颗粒。这些纤维呈现出特有的条纹图案。

讨论

临床RET研究表明，将SynOss Putty放入根管并诱导出血后，可以导致根管内的完全或部分矿化[8],[9]。尽管取得了这些有希望的临床结果，但矿化形成的机制仍不清楚。特别是，血液来源成分与基于胶原蛋白的支架之间的相互作用尚未得到系统研究。理解这种协同作用对于设计能够促进细胞介导的支架至关重要

结论

总之，本研究为临床观察到的SynOss Putty与诱导出血联合使用所导致的根管内矿化提供了机制上的解释。我们的发现表明，SynOss Putty是胶原蛋白和合成羟基磷灰石的物理混合物，而不是完全整合的复合材料。作为血液主要成分的纤维蛋白，在调节支架结构、机械性能和生物活性方面起着关键作用。

资助

作者披露了本研究、文章作者身份和/或发表所获得的以下财务支持：本研究得到了G. Harold and Leila Y. Mathers慈善基金会、纽约州立大学研究基金会管理的SUNY Technology Accelerator Fund（TAF）、Renaissance医学院的TRO临床研究奖、Technion Russell Berrie纳米技术研究所（RBNI）、NSF-MRI资助（项目编号OCE-1336724）的支持

利益冲突声明

作者声明在本文的研究、作者身份和/或发表方面不存在潜在的利益冲突。

致谢

作者感谢Yeshayahu Talmon博士和Technion软物质电子显微镜中心（TCEMSM）在冷冻扫描电子显微镜样品制备和成像方面的帮助；以及SoMAS的NAno-Raman分子成像实验室（NARMIL）在拉曼数据采集方面的支持。