本研究探讨了细胞水合不足（低水合）作为年龄相关功能衰退和疾病易感性的一个重要风险因素。利用亨廷顿病（HD）细胞模型，作者系统评估了渗透压依赖性调控对以下两个关键过程的影响：（1）以多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展的突变亨廷顿蛋白-EGFP报告蛋白（mHTTExon1-EGFP）的聚集作为结构动态疾病蛋白的读数；（2）以HSP70伴侣蛋白的诱导作为应激下折叠蛋白不稳定性的报告。通过向细胞培养基中添加细胞不可渗透的碱金属盐（如氯化钠）或聚乙二醇（PEG）来造成高渗环境使细胞脱水并增加大分子拥挤，或通过加水制造低渗环境使细胞膨胀以实现大分子分散。
细胞成像和生化分析结果显示，向培养基中添加氯化钠等碱金属盐，会促进活细胞中mHTTExon1-EGFP蛋白聚集成称为“包涵体”（IB）的聚集体，同时抑制了热休克对HSP70的诱导。相反，低渗培养基则能缓和mHTTExon1-EGFP压缩形成IB的过程，同时增强HSP70的诱导。细胞不可渗透的PEGs同样促进了mHTT的聚集。这些观察结果强调了等渗细胞环境对于维持无序与折叠蛋白质组的结构和功能平衡至关重要，偏离这一理想环境会对蛋白质稳态产生严重后果，从而易于导致疾病蛋白聚集和应激脆弱性。
引言
衰老与细胞环境和生理学中众多原发性和下游变化相关。从酵母、蠕虫、鱼类到人类，两个显著常见且保守的年龄相关变化是：（1）细胞水合减少；（2）多种蛋白质在衰老细胞和生物体中脱溶剂形成聚集体或沉淀物的倾向增加。大量证据表明，细胞水合减少和水流动性减慢（如衰老细胞和生物体中的情况）会对大分子，特别是结构上具有扩展性和动态性的内在无序蛋白（IDPs，包括许多调控蛋白和疾病蛋白）的流动性和功能产生连锁影响。亨廷顿病（HD）是一种由亨廷顿基因（Htt）中多态性CAG三核苷酸重复序列扩展引起的单基因、常染色体显性神经退行性疾病（ND），该突变编码了突变亨廷顿蛋白（mHTT）中扩展的多聚谷氨酰胺链。HD症状的出现具有年龄延迟性，且与polyQ扩展程度（>35）呈负相关，通常在成年患者40多岁时显现。年龄是阿尔茨海默病（AD，平均发病年龄在60多岁）和帕金森病（PD，通常在50至65岁之间发病）这两种最常见ND的最大风险因素。这些ND的一个共同病理发现是细胞/组织中疾病蛋白聚集物的沉积，如HD中的亨廷顿包涵体（IB）、AD中的β-淀粉样蛋白斑块和tau蛋白神经纤维缠结，以及PD中的α-突触核蛋白聚集形成的路易体。
本研究旨在深入探讨细胞水合和大分子拥挤的年龄相关变化是否以及如何驱动蛋白质组结构动力学的改变，并促进疾病蛋白聚集以及衰老细胞和生物体对环境应激的脆弱性。为此，我们使用渗透工具改变HD细胞模型的细胞体积、水合作用和大分子拥挤度，从而评估活细胞中无序/非结构化蛋白质与有序/结构化蛋白质结构动力学的相应变化。我们监测了mHTTExon1-EGFP报告蛋白的聚集作为IDP类的读数，而HSP70伴侣蛋白的诱导则用于评估热应激下折叠蛋白的动态不稳定性。我们的结果为折叠蛋白组与无序蛋白组在细胞渗透环境变化时受到动态且相反的调控提供了证据，从而强调了进化上保守的约300 mOsM等渗细胞环境对于蛋白质组稳态和细胞功能至关重要。
结果
碱金属盐改变细胞培养基高渗性并影响细胞内mHTT动力学
盐诱导的高渗应激可在活细胞中快速（几秒到几分钟内）且显著地触发低水合和大分子拥挤。在如图1所示的实验中，将指定浓度（毫渗摩尔/升；mOsM）的碱金属盐（LiCl、NaCl、KCl和RbCl）添加到约300 mOsM的等渗细胞培养基中，并在37°C孵育24小时，以诱导细胞内高渗/低水合，并评估其对活细胞中mHTT扩散形式与聚集形式动态平衡的相应变化。
代表性细胞图像（图1A）显示，在等渗培养基中，对照组细胞超过95%的mHTT信号呈可溶的扩散形式，而在添加了160 mOsM碱金属盐（LiCl、NaCl、KCl、RbCl）的培养基中于37°C孵育24小时，能有效地驱动扩散的mHTT压缩并聚集成明亮的微米大小（平均直径约5μm）的胞质IB。作为比较，图1A的细胞图像面板中包含了先前已证明可促进mHTT聚集和IB形成的条件（42°C热休克2小时或4°C冷休克2小时，然后在37°C恢复培养22小时）下的细胞图像。
为了评估和比较这些盐在促进mHTT聚集形成IB方面的功效顺序，我们定量并展示了在37°C、含指定浓度盐的培养基中孵育24小时的细胞中，mHTT以扩散形式与聚集IB形式的百分比（图1B）。特定处理条件下每个细胞的mHTT IB计数如图1C所示。结果表明，在正常生长温度37°C下，向培养基中添加碱金属盐会按所添加盐的[mOsM]比例驱动mHTT IB的形成。观察到的这种盐依赖性效应的功效顺序是LiCl ≥ NaCl > KCl ≥ RbCl——这一顺序与先前报道的这些盐对α-突触核蛋白聚集的体外效应顺序相近，这可能表明碱金属盐离子对水流动性的普遍影响会作用于结构扩展的疾病蛋白的流动性，从而促进其压缩和聚集形成。如图1所示的这些微米大小的胞质mHTT IB是终末阶段高度交联的物质，可通过离心细胞裂解物沉淀；其普遍的圆形形状表明它们是通过液-液相分离形成的。
对细胞HSP70伴侣蛋白的免疫染色（图1A，细胞图像，红色信号）——作为折叠蛋白不稳定性的读数——显示碱金属盐对正常生长温度37°C下细胞的低基础HSP70表达几乎没有影响。作为比较，结果显示在42°C热休克2小时后HSP70蛋白显著增加，而在4°C冷休克2小时然后在37°C恢复培养的细胞中HSP70也有更温和的增加，这与先前报道一致。
高渗和低渗应激下细胞mHTT聚集与HSP70的截然相反调控
真核生物蛋白质组涵盖整个结构谱——从稳定折叠到内在无序，且无序蛋白的比例在进化过程中不断增加。从目的论角度看，大分子拥挤与分散预计会对处于结构谱两端的蛋白质天然状态产生相反的影响：拥挤会驱动压缩，主要影响结构扩展和动态的IDP类；而大分子分散则会促进紧密折叠的蛋白质结构在 destabilizing conditions 下的解离，例如在细胞受到短暂热休克时。
在图2所示的研究中，使用生理盐水NaCl和水来滴定细胞培养基渗透压，以改变细胞内水合作用和大分子拥挤度，并评估其对以下方面的下游影响：（1）mHTT压缩聚集形成IB，作为结构扩展和无序蛋白类的读数；（2）短暂热休克后HSP70伴侣蛋白的诱导，作为应激下天然折叠蛋白不稳定性的读数及其需要HSP伴侣蛋白帮助以重新折叠发挥功能的指标。
对于维持在正常生长温度37°C、等渗细胞培养基中的细胞，超过90%的mHTT信号呈可溶的“扩散”形式（图2A，左侧：37°C对照）。添加NaCl提高培养基渗透压（300–460 mOsM）支持了活细胞中mHTT压缩和聚集的梯度增加；在37°C孵育24小时后，mHTT IB信号强度百分比从等渗基线约3%增加到高渗（460 mOsM）培养基中的约15%（图2B，第一组柱状图）。
热休克通过诱导HSP伴侣蛋白已被证明可促进扩散的mHTT结构化、压缩并形成IB。在此，我们研究了热休克诱导的mHTT IB形成增加是否可能通过同时改变细胞培养基渗透压来滴定。图2A右半部分的代表性细胞图像显示了在等渗（300 mOsM）、高渗（440 mOsM）和低渗（200 mOsM）细胞培养基中维持的热休克细胞的mHTT（绿色）和HSP70蛋白（红色）在形态和强度上的差异。图2B中mHTT信号以扩散形式与聚集IB形式的百分比定量显示，热休克后在37°C恢复培养12或24小时增加了mHTT聚集成微米级IB，这与我们之前的报告一致。重要的是，这种热休克诱导的mHTT IB形成增加，会因细胞培养基渗透压从300 mOsM增加到460 mOsM而强烈且成比例地增强，反之，会因细胞培养基渗透压从300 mOsM降低到187 mOsM而逐渐减弱。在42°C热休克后于37°C恢复培养12小时或24小时观察到性质相似的结果，更长的24小时恢复培养期支持了mHTT聚集和IB形成的更大增加（占总mHTT的百分比，图2B）。
通过细胞免疫染色对[HSP70]的同时评估（图2C）显示：（1）在42°C短暂热休克后在37°C恢复培养，显著增加了HSP70蛋白的丰度，无论是在12小时还是24小时恢复培养后，且较长的24小时恢复培养比短的12小时恢复培养增加约30-40%。（2）这种热休克诱导的HSP70积累，因细胞培养基渗透压从300 mOsM逐步增加到460 mOsM（导致大分子拥挤和结构压缩）而成比例地受到抑制。（3）相反，细胞培养基渗透压从300 mOsM逐步降低到187 mOsM（导致大分子分散和松弛）成比例地增强了细胞短暂热休克对HSP70的诱导（图2C）。
细胞渗透环境动态调节热休克转录反应
热休克反应（HSR）是一种进化上保守的应激诱导转录反应，由温度或应激诱导的天然折叠蛋白结构内部疏水核心解折叠和暴露引发，导致热休克因子1（HSF1）转录因子激活，并增加一类蛋白质伴侣——热休克蛋白（HSPs）的转录和翻译。HSPs对于应激下折叠蛋白质组的稳态（即蛋白质稳态）至关重要：它们可遮蔽暴露的疏水核心并防止未折叠蛋白质结构聚集，协助其重新折叠，并促进降解——这些过程对于应激后恢复折叠蛋白质组的功能至关重要。此外，HSPs在细胞信号转导、细胞周期和凋亡调控中扮演重要角色，其失调与多种疾病状态有关。总之，HSR主要作为折叠蛋白质组的“守护者”。因此，巩固细胞中折叠蛋白质结构的条件预计会减少对HSP伴侣蛋白的需求，而破坏折叠蛋白质结构、暴露疏水核心的条件则会增加应激后恢复天然折叠蛋白质结构对HSP伴侣蛋白的需求。
在图3所示的实验中，在低渗（200 mOsM）、等渗（300 mOsM）和高渗（460 mOsM）培养基中平衡的细胞在42°C热休克2小时，然后在37°C恢复培养指定时间，以确定HSP70的诱导和积累。图3A、B展示了HSP70蛋白的免疫-蛋白质印迹定量结果，显示细胞在42°C短暂热休克2小时后于37°C恢复培养，HSP70蛋白丰度随时间增加；这种热休克诱导的HSP70蛋白积累的增加顺序为：低渗（200 mOsM）> 等渗（300 mOsM）≫ 高渗细胞培养基（460 mOsM）。
在图3C所示的实验中，我们利用hsp70基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因进一步评估细胞渗透环境变化对热休克转录反应诱导的影响。为此，细胞用hsp70-荧光素酶报告基因DNA以及作为内参的雷尼利亚荧光素酶（RLU）DNA共转染。结果显示，热休克诱导的hsp70报告基因活性的增加，因细胞培养基渗透压从300 mOsM逐步增加到460 mOsM而成比例地受到抑制。相反，这种热休克诱导的hsp70启动子报告基因活性，因细胞培养基渗透压从300 mOsM逐步降低到187 mOsM（导致大分子分散和应激下折叠蛋白质结构的解离）而成比例地增强。图3C中对基础（即37°C）hsp70报告基因活性的评估显示，随着细胞培养基渗透压从300 mOsM降低到187 mOsM，基础hsp70报告基因活性有微小但统计学上显著的增加，而将细胞培养基渗透压从300 mOsM增加到460 mOsM对37°C基础hsp70报告基因活性有趋势性但不显著的影响。
总之，图3的结果以及图2C的HSP70免疫染色结果提供了明确证据，表明热休克转录反应的诱导——用于短暂热应激后恢复折叠蛋白质组——会受到细胞渗透环境变化的成比例调节：在高渗环境下，由于拥挤和折叠蛋白质组的稳定化而受到抑制；相反，在低渗环境下，由于大分子分散和热应激下折叠蛋白质结构的不稳定性而得到增强。
细胞不可渗透的聚乙二醇促进活细胞内polyQ扩展mHTT的压缩和聚集形成IB
为了确认渗透压依赖性调节mHTT动力学的观察结果，并减轻所用盐的非特异性离子和电荷效应带来的担忧，我们转向一类非电荷渗透剂——聚乙二醇（PEG），这类物质因其在临床程序中增加液体渗透压以清洁胃肠道的有效性而广为人知。我们的初步测试包括PEG 400、600、1500、2000和3000。较低分子量的PEG 400和600被证明具有急性细胞毒性，很可能是由于它们的分子量较低并能渗透进入细胞，正如先前报道。因此，这些低分子量PEG被排除在进一步实验之外。
对照组细胞以及在与4% PEG 1500、2000和3000在37°C孵育8小时的细胞代表性图像如图4A所示。这些细胞图像以及图4B中每个细胞的IB计数结果显示，向细胞培养基中添加4% PEG 2000和3000会导致mHTT聚集和IB形成随孵育时间增加。在相同实验条件下，PEG 1500对mHTT动力学在长达8小时的37°C细胞孵育中无显著影响。图4C中对4% PEG2000处理的细胞IB大小分布的分析显示，小核IB（平均直径约2μm）显著增加，尤其是在细胞用PEG 2000处理较长时间（6–8小时）后，以及较大的胞质IB（平均直径约5–6μm）也增加。在PEG 2000/3000处理的细胞中观察到的这种小核IB增加，让人联想到我们之前报道的短暂热休克效应。
细胞体积评估
细胞渗透环境的变化对细胞体积和大分子拥挤具有快速（几秒到几分钟内）和动态的影响。为了评估和确认在添加了NaCl或PEG的培养基中孵育的细胞发生的快速体积变化，我们使用Cy5标记的麦胚凝集素（WGA）（一种结合细胞表面聚糖的荧光探针）来追踪细胞轮廓，以便通过荧光显微镜测定细胞高度。图5展示了用Cy5-WGA标记的对照组细胞（图5A）以及在37°C用补充了NaCl（70 mM，140 mOsM；图5B）和PEG 3000（4%，13.3 mOsM；图5C）的培养基孵育30分钟后再固定并进行细胞表面标记以测定细胞高度的细胞正交视图。
为了定量测定不同实验条件下的细胞高度，我们确定了单个细胞的Z轴荧光强度分布，即细胞高度或厚度。荧光强度分布的半高全宽（fwhm）被用作不同处理条件下细胞高度的指标。图6A中的小提琴图以及图6B中的定量表显示，对照细胞的平均细胞高度为25.9μm，而NaCl处理细胞的平均细胞高度为13.6μm，PEG2000处理细胞为20.3μm，PEG3000处理细胞为20.6μm。这些结果清楚地表明，在补充了NaCl或PEG2000/3000的高渗细胞培养基中孵育细胞30分钟，会急剧且显著地降低细胞高度，进而推断降低细胞体积。评估细胞在高渗细胞培养基中孵育更长时间（>1小时）后的细胞高度变化显示，细胞体积通过进化上保守的调节性体积增加（RVI）机制出现反弹，即通过适应性增加细胞内渗透剂和离子以达到渗透平衡并恢复细胞体积。重要的是，新“体积调节”后的细胞内环境是高渗的（即>300 mOsM），并与高渗的细胞外环境达到平衡。
讨论
“年龄相关的ND”强调了年龄是疾病表现的主要风险因素。这类疾病通常以广泛沉积显微镜下可见且不溶的疾病蛋白聚集体，以及疾病特异性神经元的退化和最终死亡为特征。广泛的疾病蛋白聚集导致特定神经元功能障碍，最终引发疾病特异性认知和运动功能障碍之间的因果关系是复杂的，仍有待阐明。然而，年龄（包括常染色体显性形式疾病）在疾病表现中的首要风险地位，表明生物体或细胞环境中存在重要的年龄相关变化，这些变化有利于疾病蛋白聚集和疾病发病机制。
本工作的重点是评估细胞渗透环境的变化（驱动细胞内大分子拥挤与分散）是否以及如何破坏蛋白质稳态导致细胞功能障碍，并促进疾病状态下的病理变化。这一假设基于衰老研究中广泛使用的各种细胞和生物体模型系统中观察到的显著的年龄相关性水合减少，最重要的是，基于衰老人群中的观察。例如，对酵母模型生物的研究提供了明确且令人信服的证据，表明年龄依赖性液泡体积增加和细胞质体积减少，导致衰老酵母细胞中大分子拥挤和下游生理变化。对高等脊椎动物模型和人类受试者的研究同样为年龄相关性水合减少导致功能障碍提供了明确证据。实际上，对认知正常的老年人进行的为期10年的连续核磁共振（NMR）研究提供了令人信服且明确的证据，表明与年龄相关（年龄约40-90岁）的脑容量减少加速，大脑皮层灰质在每个脑叶均表现出与年龄一致的体积减少模式。这些变化伴随着脑脊液（CSF）填充空间的增加。
在本工作中，我们使用实验性渗透工具来引发细胞水合变化，从而驱动大分子拥挤与分散，并探究这些变化是否以及如何影响蛋白质组（从结构扩展和无序到紧密折叠和有序）的结构和功能动力学，以解释疾病蛋白聚集以及衰老细胞/生物体应激脆弱性的众所周知现象。为此，我们使用了一个HD细胞模型，其中结构无序的mHTT-EGFP报告蛋白压缩成微米大小的聚集体（称为“IB”），可以通过荧光显微镜和细胞图像分析轻松追踪。我们的结果表明，高渗细胞培养基导致的拥挤和低水合细胞内环境促进了结构动态和内在无序的mHTT压缩形成微米级IB。相反，低渗培养基导致的过度水合和分散的细胞内环境，在抑制mHTT压缩和IB形成方面效果有限，但仍然具有统计学显著性。同时分析HSP70蛋白在这些细胞渗透压变化下的诱导情况（作为应激下折叠蛋白质组结构不稳定性的读数及其需要HSP伴侣蛋白帮助重新折叠的需求），揭示了一种与结构无序的mHTT报告蛋白相反的调控模式。我们在本工作中表明，高渗介质（导致低水合和大分子拥挤）抑制了细胞短暂热休克后HSP70的诱导，而促进细胞内过度水合和大分子分散的条件则增强了HSP70的诱导。值得注意的是，我们目前观察到的渗透压依赖性抑制HSP70诱导的现象，让人联想到我们和其他人先前报道的在衰老研究的各种细胞和生物体模型中众所周知的“年龄”相关热休克转录反应诱导减弱。总的来说，这些过去的观察和我们目前的结果表明，热休克转录反应减弱是低水合和拥挤细胞环境的一个特征，这种环境巩固了折叠蛋白质组——无论是如本工作中实验诱导的，还是如先前报道可能在衰老细胞或生物体中自然发生的。
我们的蛋白质组涵盖了整个结构谱——从稳定折叠到内在无序。对于高等真核生物，约30-50%的蛋白质组在整体或部分上是结构无序的。折叠蛋白质以其准稳定性著称，其折叠 → 解折叠的ΔG值通常落在相对较窄的5到15 kcal/mol范围内。IDPs由于疏水性氨基酸残基匮乏，在天然状态下结构扩展、柔韧，具有高溶剂可及性和构象熵。大分子拥挤通过排阻体积效应提高了所有溶质的有效浓度，并限制了熵驱动的过程。拥挤的影响在很大程度上取决于所考虑的蛋白质的天然结构——压缩结构扩展和动态的IDP类，同时巩固折叠蛋白质结构。在正常生长温度37°C下，拥挤提高了有效浓度并限制了IDPs的动态流动性，从而促进其压缩和聚集，正如本工作中通过滴定mHTT-EGFP报告蛋白聚集作为细胞渗透环境变化函数所证明的。相反，大分子拥挤会限制，而分散则会增强折叠蛋白质结构依赖于温度的熵解离，从而按比例调节它们对HSP伴侣蛋白重新折叠的需求和诱导，正如我们通过细胞短暂热休克后HSP70伴侣蛋白诱导的渗透压依赖性调节所展示的。
重要的是，在维持细胞稳态方面，“有序”与“无序”蛋白质组之间存在基本的结构和功能相互作用。例如，HSF1——感知应激以诱导HSP伴侣蛋白的关键转录因子——配备了功能调节所必需的结构无序区域。新合成的HSP伴侣蛋白也具有结构无序区域，作为柔性的分子识别元件，结合折叠蛋白暴露的易聚集疏水区域，促进其重新折叠以恢复细胞稳态。总之，在正常等渗条件下，折叠与无序蛋白质组的功能性存在平衡的动态相互依赖性，这种平衡会被细胞渗透环境的变化（导致大分子拥挤与分散）所扰乱。
总的来说，这些观察和思考强调了约300 mOsM的最佳水合细胞环境至关重要，这是跨越不同生物的进化上保守的细胞环境，反映了细胞渗透压在大分子功能、细胞功能和生存中的关键作用。偏离这一理想状态，如在低水合的衰老和疾病状态下可能发生的那样，将产生重大的下游后果，扰乱稳定折叠与动态无序蛋白质组的平衡功能，并驱动细胞功能障碍，导致疾病发病机制。至于大脑，尤其是神经元，为何可能特别容易受到这种年龄相关性水合变化的影响，重要因素包括大脑正常功能所必需的体积和离子组成限制，使得外周组织和胶质细胞普遍采用的有效细胞体积控制机制可能对神经元功能产生显著的负面影响。首先，成熟的大脑被包裹在坚硬的颅骨内，这极大地限制了中枢神经系统组织及其功能成分可以膨胀或收缩的程度，而且神经元显著缺乏水通道蛋白（aquaporins）进行水转运。其次，大脑是可兴奋组织，细胞内和细胞外K+、Na+和Cl–水平的变化，虽然有助于外周组织的细胞体积控制，但将不可避免地并显著地改变神经元的兴奋性。第三，与水合相关的脑内血管周围空间的体积和功能变化直接影响代谢废物的清除以维持大脑稳态。最后且重要的是，许多“经典”的生物相容性有机渗透剂，如在哺乳动物肾脏和海洋生物中用于体积控制的，包括甘氨酸、γ-氨基丁酸、牛磺酸和谷氨酸，在中枢神经系统中是重要的信号分子或神经递质，这排除了它们作为渗透调节剂的使用。
这项工作为现有文献证据体系做出了贡献，强调了等渗细胞环境对于维持从紧密折叠到内在及动态无序的整个细胞蛋白质组功能平衡至关重要。这种平衡的破坏，如可能发生在衰老和疾病状态下，将对细胞蛋白质组的功能产生重大影响，并具有重要的下游生理和病理意义。
