引言
高效的生物催化过程需要对生物催化剂和反应条件进行集成优化。受自然界生物分子结构的启发，金属有机框架（MOFs）已成为有前景的酶固定化平台，所形成的酶@MOF（E-MOF）生物催化剂能提供生物相容的微环境，增强酶的稳定性和可回收性。然而，实现高封装效率和高保留酶活性仍具挑战。传统单配体MOF系统表面相对均质，往往导致酶-MOF界面相互作用欠佳。多变量配体策略通过精细调节疏水性和电荷，可定制酶-MOF界面，创造优化的微环境。此外，反应条件在级联反应中也起决定性作用，但以往研究多将反应性能作为材料表征工具，对反应条件进行系统优化以提升级联生产率的研究相对被忽视。机器学习已被分别应用于E-MOF合成和酶催化优化的研究，但目前尚无研究报道对E-MOF合成及其下游生物级联条件进行集成优化的序贯机器学习策略。
本研究通过结合多变量材料设计和序贯机器学习优化策略来解决这些挑战。具体而言，研究者采用拉丁超立方采样-耦合迭代贝叶斯优化（LHS-BO）工作流来指导整个生物催化优化研究。
结果与讨论
考虑到酶-MOF界面相容性的重要性，研究首先分析了葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）的表面化学性质。分析表明，两者的表面电势和亲疏水域分布存在显著差异，这提示它们与功能化配体的相互作用可能不同，因此其最优E-MOF合成条件也应不同。为此，本研究采用了多变量羧酸配体策略，使用疏水的ibdc-hexane、中性亲水的ibdc-EG以及带正电荷的ibdc-TEA配体，在Zr基E-MOF生物界面中模拟蛋白质的异质性表面特征，为每种酶创建量身定制的微环境。
利用LHS-BO工作流，研究者定义了包含ZrOCl2、三种功能化ibdc配体及酶浓度的合成设计空间。拉丁超立方采样用于高效选择代表性的种子条件，迭代贝叶斯优化则用于微调这些条件以最大化固定化性能。梯度提升模型被用作工作流中的替代模型。为了平衡酶成本和活性保留，采用性能指数作为优化目标。结果表明，E-MOFGOx和E-MOFHRP的封装效率、保留活性和性能指数值在不同的合成条件下变化很大，这证明了前体浓度和配体组成对固定化性能的强烈影响，也支持了多变量配体设计策略的基本原理。
特征重要性分析揭示了影响固定化性能的关键因素。对于两种E-MOF，ibdc-hexane的用量是影响封装效率的最重要因素，而ibdc-TEA对封装效率有负面影响。对于保留活性的预测，两种酶的关键因素不同：在E-MOFGOx中，ibdc-hexane和ibdc-TEA强烈影响保留活性；而在E-MOFHRP中，ibdc-EG是主导因素，这与文献中聚乙二醇能稳定HRP三级结构的报道一致。
研究确定了ZG67和ZH16分别为性能最佳的E-MOFGOx和E-MOFHRP。ZG67表现出92.2% ± 0.7%的封装效率和87.1% ± 2.2%的保留活性；ZH16表现出90.2% ± 1.3%的封装效率和相对于游离HRP高达1020.9%的保留活性。两者在热应激和有机溶剂暴露条件下均保留了大部分生物活性，而游离酶在相同条件下活性大幅丧失。控制实验表明，表面吸附酶的样品并未表现出稳定性提升，证实了观察到的保护作用源于酶在E-MOF基质内的封装。
衰减全反射傅里叶变换红外光谱分析显示，封装后两种酶的二级结构发生了显著变化，α-螺旋含量增加，无规卷曲减少，表明封装能稳定更有序的、具有催化活性的酶构象。紫外可见光谱分析也支持了酶微环境的变化。
研究提出，观察到的生物活性增强部分源于酶-MOF界面独特的微环境。E-MOF环境可能通过限制和界面相互作用，在接近中性的本体条件下局部稳定质子化状态，从而功能性地模拟酶的酸性激活。pH依赖性活性测试和酶吸附实验的结果支持了这一假设。
在确定了最佳生物催化剂后，研究应用LHS-BO工作流优化GOx-HRP级联反应。在典型的级联反应中，葡萄糖被GOx氧化生成H2O2，HRP随后利用H2O2>氧化邻苯二胺生成2,3-二氨基吩嗪。在优化工作流中，将葡萄糖、ZG67、ZH16和邻苯二胺的浓度作为变量，初始DAP生成速率作为优化目标。
经过52次实验，研究确定了R49为GOx-HRP生物级联的最佳反应条件。训练好的梯度提升模型能准确预测DAP生成速率。特征重要性分析表明，ZG67和葡萄糖的浓度是影响DAP生成速率的两个主导因素，提示GOx催化的H2O2生成是级联反应的限速步骤。这一发现与对ZG67和ZH16的详细动力学分析结果一致。动力学分析显示，封装提高了两种酶的最大反应速率和转换数，其中HRP的转换数提升尤为显著。同时，封装也增加了米氏常数，反映了E-MOF基质内的扩散障碍。
基于实验测得的动力学参数，研究者开发了一个微动力学模型来模拟DAP生成。该模型与实验数据高度吻合。使用该模型对超过9万种可能的反应条件进行筛选，确定了理论最优条件K1。实验上，K1实现了与预测非常接近的DAP生成速率。值得注意的是，LHS-BO工作流独立确定的R49条件，仅通过52次实验就实现了理论最优值K1的95.5%。这凸显了LHS-BO工作流在高效识别接近最优的生物级联条件方面的潜力，同时也能捕捉反应的关键机理特征。
结论
本研究提出了一种用于E-MOF基生物催化序贯优化的策略，集成了多变量设计与机器学习指导的反应优化。利用LHS-BO工作流，研究者序贯优化了E-MOF合成和下游GOx-HRP生物级联，实现了超过95%理论最大DAP生成速率。混合配体Zr基E-MOF有效地将GOx和HRP稳定在其生物活性构象中，提供了高封装效率、高保留活性以及在多变pH、热和溶剂条件下的鲁棒性。重要的是，实验结果、动力学模型和机器学习预测在DAP生成速率值上表现出高度一致性，证实了这种集成方法的可靠性。总体而言，这项工作为多酶级联系统的自适应设计建立了一个通用框架，将宿主工程和反应优化相结合，以实现稳健、高性能的生物催化。
实验部分
所有化学品和溶剂均购自商业来源并按原样使用。功能化间苯二甲酸配体根据文献方法合成。
E-MOF的系统筛选：典型合成中，将所需体积的ZrOCl2·8H2O、三种ibdc配体、酶和水混合。合成总体积为0.5 mL，在室温下旋转孵育30分钟。通过离心收集沉淀物并清洗。上清液用于BCA测定以计算封装效率。
粉末X射线衍射：使用配备Cu Kα辐射的衍射仪进行。
衰减全反射傅里叶变换红外光谱分析：使用红外光谱仪在2200至400 cm-1光谱范围内收集光谱。
Zeta电位测量：使用动态光散射仪在pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中测量。
溶液态核磁共振：使用核磁共振波谱仪进行。
封装效率的定量：使用BCA法测定上清液中的酶浓度，并计算封装效率。
GOx和E-MOFGOx的酶活测定：以邻苯二胺为底物，在96孔板中监测418 nm处吸光度的变化，评估GOx活性。
HRP和E-MOFHRP的酶活测定：以H2O2为底物，邻苯二胺为氢供体，监测418 nm处吸光度的变化，评估HRP活性。通过初始反应速率计算保留酶活性。
机器学习辅助实验规划：种子数据集的实验规划采用拉丁超立方采样。贝叶斯优化算法与梯度提升回归模型结合使用，通过最大化期望改进采集函数来识别有前景的E-MOF候选物。在迭代阶段，从算法生成的30个设计中，根据预测的性能指数值降序排列，选择前12个候选物进行进一步评估。
