引言
现代生活方式与健康意识的提升极大地塑造了人们的饮食习惯，对方便、营养密集型食品的需求推动了功能产品市场的发展，其中蛋白棒已成为增长最快的品类之一。蛋白棒起源于20世纪80年代，主要面向运动员和素食者，如今已成为广受欢迎的主流食品。其受欢迎源于高营养密度、便携性和无需烹饪的特点。典型的蛋白棒含有20%–50%的蛋白质、20%–50%的碳水化合物和10%–20%的脂肪。乳清蛋白因其营养价值和理想的感官特性而被广泛使用。碳水化合物有助于形成质地并防止糖结晶，而脂质则能增强延展性。糙米粉也越来越多地被用作功能性配料，因为它含有生物活性植物化学物质（生育酚、生育三烯酚、γ-谷维素、酚类化合物）、纤维、维生素和矿物质，有助于预防慢性疾病。
然而，贮藏期间蛋白棒硬化是一个关键挑战，这会降低消费者的可接受性。这与水分活度变化、糖结晶、美拉德反应以及通过二硫键形成的蛋白质聚集有关。由于质地和颜色是消费者偏好的关键因素，减缓这种品质劣变至关重要。多酚类化合物提供了一个有前景的解决方案。作为植物次生代谢物，它们范围广泛，从酚酸到类黄酮和单宁，具有很强的抗氧化性能。它们不仅能保护食品免受氧化，还能通过降低癌症、2型糖尿病和消化系统疾病的风险来促进人类健康。谷物及其加工副产物是宝贵的多酚天然来源。
米糠作为糙米的外层，尤其富含多酚以及蛋白质、脂肪、维生素和矿物质。它过去主要用作动物饲料，现在已被公认为功能性食品配料。米糠提取物表现出抗氧化能力，增强氧化稳定性，并与蛋白质相互作用，影响其结构和功能。传统上被视为低价值的副产品，它现在代表着一种未充分利用的资源，具有很高的增值应用潜力。最近的研究表明，米糠可以转化为功能性食品配料、生物活性化合物和强化剂，这不仅增强了食品产品的营养和功能特性，还有助于通过将碾磨残留物转化为宝贵资源来实现废物最小化和循环经济。将其纳入蛋白棒、烘焙食品和零食等产品中，可以改善质地、稳定性和货架期，同时减少环境影响并最大化资源利用效率。因此，将这些提取物加入蛋白棒可能有助于延缓硬化、改善质地并延长货架期。
提取方法在很大程度上决定了酚类物质的组成。有机溶剂浸渍法仍然很常见。尽管甲醇过去很有效，但其毒性限制了其在食品中的应用。乙醇是一种安全且极性的溶剂，能高效提取多种酚类物质。水是另一种传统、环保的溶剂。因此，米糠的乙醇提取物和水提物都是食品强化的合适候选者。
尽管植物提取物作为各种食品基质中的天然抗氧化剂和稳定剂已被广泛研究，但它们在蛋白棒系统中的应用，特别是源自米糠的提取物，仍未得到探索。鉴于米糠是一种营养丰富但未被充分利用的副产物，其价值化与当前可持续食品配方和循环经济战略的全球优先事项相符。因此，本研究评估了米糠水提物和醇提物如何调节以糙米为基础的蛋白棒的理化、抗氧化、微生物、感官和蛋白质二级结构特性。除了常规的功能评估，这项工作独特地整合了FTIR衍生的二级结构分析与化学计量学工具[主成分分析（PCA）和偏最小二乘回归（PLSR）]，以揭示多酚-蛋白质相互作用、质地演变和感官结果之间的机制联系。这种分析-多元联合框架使本研究有别于以往关于蛋白棒的研究，并提供了一个新颖的、以优化为导向的视角，这在任何添加了米糠提取物的植物基蛋白棒研究中都未曾报道。
材料与方法
材料
稳定米糠和稳定糙米粉购自Giltaz公司（伊朗吉兰省）。根据制造商提供的信息，该面粉含有约8.7%水分、14.6%蛋白质、15.4%脂肪、1.2%灰分、9.4%粗纤维和35.22毫克/100克植酸。乳清蛋白浓缩物（WPC）购自Ruysa商店（伊朗马赞德兰省），根据制造商说明，含有约80%蛋白质、6%–8%乳糖、5%–7%脂肪和2%–4%水分。其他配料包括作为保湿剂和增塑剂的食品级甘油、作为脂质来源的精炼葵花籽油以及用于水合作用的蒸馏水。所有配料均为食品级，未经进一步纯化直接使用。
方法
米糠水提物与醇提物的制备
米糠水提物和醇提物在Giah-Kala公司（伊朗萨卜泽瓦尔市）使用浸渍法制备。稳定米糠过筛后，取25克与100毫升蒸馏水或无水乙醇混合。将混合物置于电动振荡器上，在室温下振荡3小时。使用含有0.15% HCl的相同溶剂100毫升，在相同条件下重复此提取过程两次。将所得提取物合并，通过0.45微米尼龙膜过滤，并在45°C下使用旋转蒸发仪浓缩。浓缩后的提取物在4°C下储存，以备后用。
蛋白棒的制备
蛋白棒在25°C下采用冷加工方法制备，以防止热敏性化合物（如乳清蛋白和米糠提取物中的生物活性成分）降解。优化的配方包含38.66%乳清蛋白、19.33%糙米粉、9.80%葵花籽油、16.01%食品级甘油和16.20%蒸馏水。
首先，将干燥配料以200转/分钟的转速混合3分钟，以达到初步均匀。然后，将液体配料（包括米糠水提物和醇提物、水、甘油和葵花籽油）逐渐加入干混合物中，并以50转/分钟的转速均质5分钟。此过程最大限度地减少了空气掺入，并确保质地均匀，没有不良空隙。
将最终混合物倒入硅胶模具（2 × 2 × 2厘米）中，以生产用于分析测试的尺寸和形状一致的样品。样品在25°C的密闭容器中储存7天以达到水分平衡。根据实验设计，加入了不同含量的米糠水提物和醇提物。提取物的添加水平（0.5%–2%）是根据蛋白棒的总湿重计算的。考虑到提取物的干物质含量，配方中相应的水量被调整以保持一致的质地和组成。该方法通过避免加热应用，保留了蛋白质的天然结构，从而保持了产品的功能、营养和感官特性。成分比例根据初步试验进行了优化，以达到均衡的质地、水分含量、结构完整性和感官接受度。
蛋白棒近似组成分析
含有米糠水提物、醇提物和米糠粉的蛋白棒的近似组成（水分、灰分、粗脂肪和粗蛋白质）根据AOAC方法测定。粗蛋白（N × 6.25）使用凯氏定氮法测量。水分含量通过在105°C下将样品烘至恒重来确定，而灰分含量在550°C下灰化后测量。脂肪含量通过酸水解后用石油醚在索氏提取器中萃取来分析。粗碳水化合物含量通过差值计算，减去蛋白质、脂质、水分和灰分值。能量值使用阿特沃特通用因子系统估算：蛋白质为4千卡/克，脂肪为9千卡/克，碳水化合物为4千卡/克。
水分活度
水分活度使用水分活度计测定。将约5克样品放入测试容器中，然后插入测量室。每个样品的最终值计算为三个重复的平均值。
pH值测量
使用校准的数字pH计对每个样品的pH值进行三重测量。为此，将2.5克均质样品与25毫升新鲜煮沸的蒸馏水混合，静置20分钟后进行测量。
酸度
将5克样品分散在50毫升蒸馏水中并彻底混合。混合物静置1小时，然后加入0.5毫升酚酞指示剂。用标准化的0.1 N NaOH溶液滴定，直至淡粉色持续30秒。
过氧化值
将4克样品与10毫升氯仿和15毫升冰醋酸混合。30分钟后，使用定性滤纸（125毫米）过滤滤液。将滤液剧烈摇晃，滴加1毫升饱和碘化钾（KI）水溶液，并将样品在黑暗中保持5分钟。然后加入等体积的蒸馏水，并用0.01 M硫代硫酸钠溶液滴定释放的碘。同时制备不含样品的空白。过氧化值（PV）以每千克样品中活性氧的毫当量（mEq O2/kg）计算。
抗氧化活性
提取物制备
通过将25克粉碎的蛋白棒与100毫升乙醇混合来制备提取物。将混合物摇晃并在室温下避光保存20小时，然后过滤。
总酚含量测定
取0.2毫升提取物与0.8毫升福林-酚试剂混合。使用乙醇/水混合物（50:50，v/v）作为空白。2分钟后，加入2毫升7.5%（w/v）碳酸钠溶液，并用蒸馏水将体积调整至10毫升。混合物在黑暗中保持60分钟，然后在725纳米处测量吸光度。
铁离子还原抗氧化能力
将1毫升提取物与2.5毫升0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和2.5毫升1%（w/v）铁氰化钾溶液混合。混合物在50°C水浴中孵育20分钟，然后加入2.5毫升10%（w/v）三氯乙酸。从中取2.5毫升，与2.5毫升蒸馏水和0.5毫升0.1%（w/v）氯化铁混合。30分钟后，在700纳米处测量吸光度。
DPPH测定
制备0.1 mM的DPPH乙醇溶液。将0.2毫升提取物与3毫升DPPH溶液混合，并在黑暗中保持30分钟。在517纳米处测量吸光度，并计算自由基清除活性。
总黄酮含量测定
取0.5毫升提取物与2.5毫升蒸馏水和0.15毫升5% NaNO2溶液混合。6分钟后，加入0.3毫升10% AlCl3.6H2O溶液。5分钟后，加入1.0毫升0.1 M NaOH和0.55毫升蒸馏水。立即在370纳米处测量吸光度。
微生物质量
将25克样品与225毫升蛋白胨水均质并进行系列稀释。将等分试样涂布在合适的培养基的重复平板上。总活菌数在营养琼脂上于37°C培养48小时后测定。霉菌和酵母在YGC琼脂上于25°C培养120小时后计数。
质地剖面分析
使用布鲁克菲尔德CT3-10K质构分析仪对糙米蛋白棒进行TPA分析。使用圆柱形探头压缩样品至30%变形，十字头速度为5毫米/秒。测量的参数包括硬度、粘附性、内聚性、胶粘性、弹性和咀嚼性。
颜色测量
使用图像处理分析颜色。在白色背景下以JPEG格式捕获RGB图像，并使用ImageJ软件进行处理。将图像转换为CIELab坐标，并计算L、a和b*值。使用Hunter–Scotfield方程计算新鲜样品和贮藏样品之间的总色差（ΔE）。计算与酶促和非酶促褐变相关的褐变指数。
FTIR光谱分析
使用FTIR（Jasco 4700，日本）在ATR模式下分析蛋白质结构变化。光谱采集范围为4000–400厘米-1，分辨率为4厘米-1。在分析之前，对所有光谱进行了彻底的预处理：进行基线校正以消除背景漂移，并应用矢量归一化以确保不同样品光谱强度的可比性。酰胺I区（1600–1700厘米-1）通过特定区域的基线校正进行细化，以增强组分分离。然后使用二阶导数变换来解析重叠峰，随后在PeakFit中进行高斯曲线拟合以量化单个二级结构组分，包括α-螺旋、分子内和分子间β-折叠、β-转角和无规卷曲。这些标准化的预处理和去卷积程序确保了蛋白质结构变化的准确和可重复表征。
感官评价
感官评价由10名成年成员（年龄23–45岁；6名女性和4名男性）组成的训练有素的小组进行，他们具有评估谷物和蛋白质基产品质量的经验。将约10克每种蛋白棒放在编码（三位数）的塑料容器中，在室温下供应。评估在盲评和随机条件下进行，使用完全随机的供应顺序，以最大限度地减少偏差。小组成员被指示在样品之间用水漱口。
评估的感官属性包括颜色、味道、气味、质地、咀嚼性、风味和整体可接受性，使用5点享乐标度（1 = 非常不喜欢，5 = 非常喜欢）。所有参与者在测试前均提供了书面知情同意书。
统计分析及优化
实验采用完全随机设计，三次重复。所有结果均以平均值±标准差表示。使用单因素方差分析分析与理化、抗氧化、微生物、颜色、感官和基于FTIR的蛋白质结构特性相关的数据，并在p < 0.05的水平上使用邓肯多重比较检验进行均值比较。
使用满意度函数方法进行多响应优化。为每个响应变量分配了具体目标（最大化、最小化或范围内）、权重和重要性级别。通过将每个响应转换为从0（不可接受）到1（完全满意）的量表来计算个体满意度值。整体满意度计算为所有个体满意度的几何平均值。
将硬度、咀嚼性、过氧化值、褐变指数、水分活度、酸度和微生物数量等属性定义为最小化；将感官属性、抗氧化活性、质地正向指数、蛋白质含量和FTIR衍生的结构定义为最大化。将颜色参数设定为在可接受的变异范围内。
优化产生了具有最高整体满意度的配方，确保了理化、抗氧化、结构、感官和质地属性的平衡增强。将PCA和PLSR应用于理化性质、FTIR衍生的二级结构和感官属性的均值中心化数据集，以研究相关性并确定整体质量性能的预测因子。
米糠水提物与醇提物的分析
米糠水提物和醇提物的近似组成因所用溶剂而异。水提物的水分（79.0%湿重）高于醇提物（30.94%湿重），这与其较高的白利糖度值相对应。蛋白质和碳水化合物含量在水提物中也更高，而灰分含量则在醇提物中更高。两种提取物的pH值相当。这些差异与溶剂的极性一致：水优先提取极性成分如蛋白质和碳水化合物，而乙醇能更有效地回收某些矿物质和亲脂性化合物。
在生物活性化合物方面，醇提物的总酚含量（TPC）明显高于水提物。这种差异归因于乙醇的半极性性质，使其能够提取游离的和与细胞壁结合的酚类物质，从而拓宽了回收化合物的范围。同样，醇提物的总黄酮含量（TFC）也高于水提物。这一发现反映了大多数黄酮类化合物的中到低极性，以及乙醇优越的渗透能力，这有助于溶解与米糠细胞壁基质结合的亲脂性黄酮类化合物。
在抗氧化能力方面，醇提物表现出更强的自由基清除和还原活性。其DPPH自由基清除活性远高于水提物，这与乙醇更高的总酚含量和提取效率一致。同样，醇提物的铁离子还原抗氧化能力（FRAP）也更高，表明其电子供给能力更强。这一结果凸显了酚类和黄酮类化合物在米糠提取物的还原活性和整体抗氧化潜力中的关键作用。
蛋白棒的理化组成
水分
水分含量是影响货架期、质地、口感和消费者可接受性的关键因素。对照样品的含水量最低，而含有米糠提取物的蛋白棒，其水分含量均高于对照。尽管初始配方经过了水分调整，但储存7天后的最终值受提取物类型和浓度的显著影响。特别是醇提物，引起了水分保留量的剂量依赖性增加。这可能是由于多酚和黄酮类化合物与水形成氢键，从而减少了储存期间的水分蒸发。有趣的是，在较高浓度的水提物处理组中，观察到水分略有下降，这可能与基质压实和水分损失有关。这些发现表明，生物活性化合物对水分保留具有双重影响，具体取决于提取物类型和浓度。
蛋白质
蛋白质是重要的营养物质，具有功能和营养双重作用。在本研究中，对照蛋白棒含有33.76克蛋白质/100克。含有水提物的蛋白棒蛋白质含量略有下降，含有醇提物的蛋白棒也是如此。蛋白质含量的减少很小，但在较高提取物添加水平时更为明显。这可能是因为提取物的非蛋白质成分对蛋白质造成了稀释，以及多酚与蛋白质氨基之间潜在的相互作用可能改变构象并降低表观凯氏定氮值。
脂肪
脂肪为身体提供能量并支持肌肉性能。蛋白棒中的脂肪含量在各处理组间没有显著差异。提取物本身几乎不含脂肪，其加入并未取代配方中的脂肪来源。因此，添加提取物不影响蛋白棒与脂肪相关的营养或功能属性。
灰分
灰分代表食物的矿物质部分。蛋白棒的灰分含量在各处理组间没有显著差异。这种稳定性反映了提取物的矿物质含量较低，并且在其测试浓度下影响有限。
碳水化合物
碳水化合物是肌肉和神经系统的重要能量底物。在本配方中，蛋白质和脂肪是主要的卡路里来源，碳水化合物的贡献较小。提取物强化并未显著影响碳水化合物含量，但含有1.5%–2%水提物的蛋白棒略有增加。这可能是由于提取物引入了水溶性碳水化合物。
能量
能量含量是关键的饮食参数。在本研究中，蛋白棒提供的能量最高可达450千卡/100克。含有2%提取物（水提或醇提）的蛋白棒能量值最低。总体而言，提取物强化对卡路里值的影响可忽略不计，保持了蛋白棒作为能量密集型零食或代餐食品的适用性。
水分活度
蛋白棒的水分活度值受提取物类型和浓度影响。提取物的添加略微降低了水分活度。这种降低归因于甘油的存在，以及多酚与蛋白质形成不溶性复合物，从而限制了水的流动性。含有水提物的蛋白棒水分活度更低，这可能进一步反映了其较高的淀粉和纤维含量，这些成分可以结合水分并形成限制自由水的致密网络。这些结果表明，米糠提取物降低了水分活度，可能有助于提高蛋白棒的微生物稳定性。
pH值
pH值是一个关键因素，影响蛋白质的功能性、乳化、凝胶化和食品的整体稳定性。在本研究中，只观察到微小的变化：对照样品的pH为6.55，而含有水提物和醇提物的蛋白棒pH值在6.51至6.55之间。这种轻微的酸性可能源于作为弱酸的多酚和有机酸。因此，添加米糠提取物并未显著改变pH值，确保了有利于产品稳定性和消费者可接受性的接近中性的条件。
可滴定酸度
可滴定酸度反映了影响风味和稳定性的有机酸总含量。在本研究中，添加水提物或醇提物对可滴定酸度没有显著影响，这与先前关于米糠提取物在益生菌饮料中的报告一致。可滴定酸度没有变化进一步证实了强化米糠提取物的蛋白棒在酸度相关质量属性方面的稳定性。
过氧化值
过氧化值表示初级脂质氧化的程度。对照样品显示出最高的过氧化值，而含有水提物和醇提物的蛋白棒过氧化值显著降低。增加提取物浓度显著降低了过氧化值，这反映了酚类和黄酮类化合物抑制脂质过氧化的抗氧化能力。醇提物比水提物更有效，这是由于其含有更高的亲脂性抗氧化剂含量。这些发现凸显了米糠提取物，特别是醇提物，作为天然抗氧化剂在改善蛋白棒脂质稳定性和延长货架期方面的潜力。
抗氧化性能
总酚含量
对照蛋白棒含有源自糙米粉的基础水平的酚类物质。添加米糠提取物显著提高了所有处理组的总酚含量，其中醇提物产生的值最高。这种差异反映了乙醇的中等极性，它允许有效地溶解游离的和结合的酚类物质，包括水提取不易获得的亲脂性部分。观察到了总酚含量的剂量依赖性增加，突出了提取物浓度作为抗氧化强化关键决定因素的作用。
总黄酮含量
黄酮类化合物作为酚类物质的一个重要亚类，在含有米糠提取物的蛋白棒中得到了显著强化。醇提物再次产生比水提物更高的值，这与许多黄酮类化合物的中等至低极性一致，这限制了它们在水中的溶解度，但有利于乙醇。观察到的增加不仅证实了生物活性化合物成功融入了蛋白棒基质，而且表明黄酮类化合物在蛋白棒系统中得到了有效稳定。
DPPH自由基清除活性
通过DPPH测定测量的抗氧化能力随着米糠提取物的添加而显著增加。对照蛋白棒表现出最低的活性，这仅归因于乳清蛋白和米粉中存在的天然抗氧化剂。相比之下，醇提物处理组显示出优越的自由基清除能力，这反映了其更高的酚类和黄酮类化合物含量，以及乙醇提取具有不同极性的多种抗氧化分子的能力。结果表明，抗氧化化合物不仅在生产过程中得以保留，而且还保持了功能活性，支持了蛋白棒作为生物活性成分载体的可行性。
铁离子还原抗氧化能力
铁离子还原抗氧化能力（FRAP）的结果与DPPH相似，对照样品显示出最低的还原能力，而含有2%醇提物的蛋白棒达到了最高水平。多酚/黄酮含量与FRAP值之间的强相关性表明，酚类物质是通过提供电子和稳定自由基而对还原活性做出主要贡献的成分。值得注意的是，醇提物比水提物更有效，这反映了其更广泛的酚类物质谱。这些结果强调，米糠提取物不仅增加了抗氧化成分含量，而且还转化为氧化稳定性的可测量功能改善。
总的来说，总酚含量、总黄酮含量、DPPH和FRAP的持续且浓度依赖性的改善清楚地表明，米糠提取物，特别是醇提物，是有效的天然抗氧化剂来源。将它们纳入蛋白棒不仅提高了营养质量，还有助于开发具有延长货架期和潜在健康促进效应的功能食品。关键的酚类成分，如阿魏酸和γ-谷维素，可能通过提供强大的抗氧化活性并与蛋白质基质相互作用来支撑这些效应，这可能影响蛋白棒的质地、弹性和感官感知。
微生物质量
添加米糠提取物降低了微生物负荷，这可能是由于酚类和黄酮类化合物与微生物蛋白质和细胞壁形成复合物。观察到两种提取物都存在浓度依赖性的下降，其中醇提物由于其更高的抗菌化合物含量以及乙醇固有的抗菌活性而发挥了更强的作用。在任何样品中均未检测到霉菌或酵母生长，这证实了卫生条件和提取物的有效性。因此，米糠提取物的联合抗菌和抗氧化特性可能协同增强蛋白棒的安全性和储存稳定性。
质地分析
质地是蛋白棒的关键质量属性，影响感官感知、消费者接受度和整体产品质量。它涵盖机械、结构和触觉特性，这些特性源于食物基质的微观和宏观结构，并受配料相互作用、加工条件、储存和水分分布的影响。进行了质地剖面分析（TPA）以评估仪器测量的质地属性，通过两次压缩样品来模拟咀嚼过程。测量的参数包括硬度、粘附性、内聚性、弹性、胶粘性和咀嚼性。这些测量有助于将仪器数据与感官感知联系起来，从而全面了解蛋白棒的质地行为。
硬度
硬度是抵抗压缩的力。对照样品的硬度最高。添加米糠提取物显著降低了所有处理组的硬度，醇提物比水提物显示出更明显的降低效果。硬度降低归因于酚类物质与蛋白质的相互作用，这可能导致蛋白质部分展开，破坏刚性结构并促进更柔软、更柔韧的基质的形成。
粘附性
粘附性是将食物从接触表面分离所需的功。对照样品的粘附性最低。米糠提取物的加入显著增加了粘附性，可能是由于提取物成分增加了内聚性和粘弹性。然而，在较高浓度下观察到粘附性下降，可能是由于过度交联或水分重新分布。
内聚性
内聚性是食物内部结合强度的量度。内聚性反映了样品在变形后保持在一起的能力。米糠提取物的加入并未对内聚性产生一致或显著的影响。水提物处理组在某些浓度下显示出轻微的增加，而醇提物处理组则显示出轻微的减少或保持不变。这可能是由于蛋白质-多酚相互作用的复杂性和竞争性效应。
弹性
弹性是样品在第一次压缩变形后恢复其原始形状和高度能力的量度。水提物处理组的弹性显著降低，而醇提物处理组的弹性与对照相比没有显著差异。降低可能是由于提取物成分干扰了蛋白质网络的弹性。
胶粘性
胶粘性是半固体食物抵抗与牙齿分离的量度。米糠提取物的加入在所有处理中都显著降低了胶粘性，醇提物比水提物显示出更强的降低效果。胶粘性降低与硬度降低一致，有助于改善质地和口感。
咀嚼性
咀嚼性是将固体食物咀嚼到可吞咽状态所需的能量。米糠提取物的加入在所有处理中都显著降低了咀嚼性，醇提物显示出更大的降低效果。咀嚼性降低与硬度和胶粘性降低直接相关，表明蛋白棒变得更柔软，更容易咀嚼，可能提高消费者的便利性和接受度。
总的来说，质地剖面分析（TPA）结果表明，米糠提取物，特别是醇提物，显著改善了蛋白棒的质地属性。硬度和咀嚼性的降低表明产品变得更柔软，更容易食用，而胶粘性的减少进一步增强了口感。这些积极的质地变化可能源于蛋白质-多酚相互作用，这改变了蛋白质的二级结构，破坏了刚性网络，并促
