木质素是地球上最丰富的生物聚合物之一，主要由三种芳香单体通过非模板化的自由基耦合聚合形成复杂的异质芳香聚合物，其单元间连接键的组成因遗传和环境因素的复杂相互作用而异。在自然界中，真菌主要负责将木质素解构为芳香化合物混合物，随后由细菌和真菌同化。工业上，木质素主要作为纸浆和造纸生产的副产品产生，并被焚烧以获取工艺热量。然而，如果能够识别出合适的同化途径，解构后的木质素可以通过工程细菌转化为高附加值产品。先前的基础研究已经描述了对多种单体芳香化合物（如原儿茶酸、阿魏酸和丁香酸）以及具有β-O-4和5-5单元间连接键的二聚体的同化途径。最近的进展进一步阐明了二聚体同化的其他途径，包括针对新底物的途径以及针对先前已表征底物的平行途径。比较这些二聚体同化途径可以阐明木质素相关芳香二聚体同化的潜在生化逻辑，并为增强木质素高值化的代谢工程提供机会。
微生物同化木质素的动机与挑战
木质素是植物生物质的主要成分之一，重量上可占干生物质的30%。由于其复杂性，将木质素转化为有价值的产品极具挑战性。选择性真菌可以将木质素解构为单体和寡聚体混合物，但该过程缓慢且难以规模化。木质素的热化学解聚，如碱催化解聚或还原催化分馏，容易破坏常见的β-O-4单元间连接键等碳氧键。由此产生的解构产物含有芳香单体和寡聚体的混合物，其中寡聚体主要包含剩余的5-5、β-1、β-5和β-β碳-碳单元间连接键。虽然复杂寡聚体混合物的化学转化很困难，但微生物通常能够同化混合原料中的碳，并可以被工程化以将碳引导至所需产品。
通过生物漏斗实现木质素高值化的最简单方法涉及将关键的同化途径组合到单一生产宿主中，如Pseudomonas putida KT2440、Parasphingobium lignivorans SYK-6或Novosphingobium aromaticivorans F199。这些菌株在分解代谢模型木质素相关芳香二聚体的能力上各不相同。然而，这些菌株都不能天然分解所有常见于解构木质素中的单体和寡聚化合物，这促使了发现和异源表达额外的分解代谢途径。
具有β-1连接键的芳香二聚体的分解代谢途径
二愈创木基丙二醇（DGPD）是一种具有β-1连接键的模型芳香二聚体，可通过木质素中螺二烯酮键的酸催化开环形成。Sphingobium paucimobilis TMY1009中率先对赤式（erythro）-DGPD的分解代谢途径进行了生化表征，但其第一个酶的基因未被克隆。随后在F199中鉴定并表征了一种能催化类似转化的酶。同源途径后来在SYK-6中得到证实，并进一步扩展到涵盖苏式（threo）-DGPD的分解代谢。
两个苏式-DGPD异构体首先通过短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族的LigD和LigL立体选择性地氧化为相应的Cα羰基类似物。然后，SDR家族的还原酶LdpB和LdpC将这些Cα羰基类似物立体选择性地还原为相应的赤式-DGPD异构体。这四种酶属于同一家族，但表现出对底物立体化学和反应方向的严格选择性。
随后，赤式-DGPD异构体可以被NTF2超家族的LdpA酶转化为木质素芪（lignostilbene）。该酶对赤式-DGPD具有严格选择性，但对两种赤式非对映异构体表现出同等的动力学特性。最后，木质素芪被木质素芪双加氧酶氧化裂解，生成两分子香草醛。SYK-6含有八种具有不同底物特异性的木质素芪双加氧酶同源物，其中几种对木质素芪有活性。F199有两种木质素芪双加氧酶，在使用DGPD生长时似乎功能冗余。
具有β-5连接键的芳香二聚体的分解代谢途径
脱氢二松柏醇（DCA）是一种具有β-5连接键的模型芳香二聚体。该化合物的分解代谢途径首先在SYK-6中描述。在SYK-6中，DCA的异构体首先被一系列混杂的氧化酶氧化为DCA-C，然后被PhcC或PhcD立体选择性地氧化为DCA-CC。接着，DCA-CC被PhcG或PhcF立体选择性地脱羧，生成二苯乙烯类化合物DCA-S。这种二苯乙烯可以被木质素芪双加氧酶氧化裂解，生成香草醛和5-甲酰基阿魏酸。
最近，在SYK-6和F199中都描述了5-甲酰基阿魏酸的等效分解代谢途径。在这两种生物中，5-甲酰基阿魏酸首先被醛脱氢酶FerD氧化为5-羧基阿魏酸，随后由LigW和LigW2脱羧酶催化脱羧生成阿魏酸。
然而，对其他细菌中DCA分解代谢的进一步研究发现了关键反应不同的分解代谢途径。在F199中，DCA氧化为DCA-C的过程与SYK-6途径相似，但随后两个DCA-C异构体通过来自β-1途径的LdpA同源物PcfL的作用，直接转化为DCA-S并释放甲醛。四种立体选择性酶PhcCDFG被单个非选择性酶有效取代。此外，在农杆菌（Agrobacterium）物种中的一种谷胱甘肽转移酶LigE也被证明可以将DCA转化为DCA-S的二苯乙烯类似物，同样释放甲醛。然而，这种LigE催化的脱甲酰化的生物学背景尚未完全确立。
具有β-β连接键的芳香二聚体的分解代谢途径
最近，在新分离的细菌菌株Novosphingobium rhizosphaerans LY中描述了一种分解代谢木脂素(+)-松脂醇的途径，该二聚体含有β-β单元间连接键。松脂醇分解代谢的第一步，即通过PinZ还原裂解呋喃环生成落叶松脂醇，此前已基于SYK-6的研究被提出。然而，SYK-6无法完全同化生成的产物，因此无法确定完整的反应途径。
正如预测的那样，LY的松脂醇分解代谢途径始于PinZ催化的还原性开环，然后通过先前在β-1和β-5途径中描述过的多种生化转化组合进行。PinZ还原裂解呋喃环产生落叶松脂醇，随后被PinY氧化为落叶松脂醇酸。接下来，脱羧酶PinX催化脱羧反应，以打开剩余的呋喃环并在芳香连接体中引入双键。该酶是来自SYK-6 β-5分解代谢中PhcG和PhcF的远缘同源物。然后，黄素细胞色素PinVW将伊菠蓝烯（imperanene）氧化为推测的醌甲基化物中间体，随后释放甲醛，生成二愈创木基丁二烯（DGBD）。DGBD类似于一个延伸的木质素芪，同样可以被木质素芪双加氧酶的同源物PinU氧化裂解。PinU催化的DGBD裂解产生香草醛和松柏醛，它们可以通过先前表征的途径被代谢。
另外，在γ-变形菌纲的Pseudomonas sp. SG-MS2中部分表征了(+)-松脂醇的分解代谢途径。虽然该途径的细节仍有待验证，但它明显不同于LY菌株中描述的途径。松脂醇的降解是由VAO/PCMH黄素蛋白家族的PinA水解酶与其共翻译表达的伙伴细胞色素PinB共同起始的。通过一个推定的邻位（ipso）羟化酶裂解羟基化松脂醇将产生两个芳香单体，最终可以通过已知途径的延伸被同化。
其他木质素相关芳香二聚体的分解代谢途径
先前的大量研究已经建立了分解代谢愈创木基甘油-β-愈创木基醚（GGE，一种具有β-O-4连接键的模型二聚体）和脱氢二香草酸（DDVA，一种具有5-5连接键的模型二聚体）的核心途径。包括GGE分解代谢中醚键裂解的细节、调控以及所得芳香单体的同化，以及DDVA分解代谢中转运蛋白的关键作用等更多细节仍在不断阐明。
在自然界中，木质素主要通过真菌（细菌也有少量贡献）使用多种漆酶和过氧化物酶被氧化解构为低分子量产物。解构的程度和所得产物的命运因菌株、生物质来源和环境条件而异。当产生寡聚体中间体时，氧化酶如漆酶和过氧化物酶可能将寡聚体裂解为单体。然而，氧化裂解与自由基中间体的自发再聚合竞争。最近的研究还发现了真菌同化木质素相关芳香单体的途径。这些真菌可以将4-羟基苯甲酸转化为羟基氢醌，然后通过β-酮己二酸途径同化。该途径在生化上类似于在Rhodococcus jostii RHA1中发现的途径，尽管所涉及的酶并不密切相关。类似于上述细菌中描述的针对模型芳香化合物的特异性分解途径，尚未在真菌中报道。细菌中此类途径的丰度表明，寡聚体在环境中普遍产生，但主要由细菌降解。细菌的同化可能通过减少木质素再聚合和缓解产物抑制而使真菌受益。
混杂性与平行生化进化
综合来看，已描述了七条针对具有β-1、β-5和β-β连接键的芳香二聚体的部分或完整分解代谢途径。在比较这些途径时，可以观察到生化上的相似性。其中六条途径（主要来自鞘脂单胞菌）生成二苯乙烯中间体，这些中间体可被氧化裂解产生单体芳香醛。第七条途径，即假单胞菌分解松脂醇的途径，则遵循与另外六条完全不同的生化逻辑。在这条推测的途径中，两个芳香部分在途径初期就被分离，然后这些单体被进一步转化为常见的分解代谢中间体，如香草醛。
这六条生成二苯乙烯的途径采用了多种平行的途径来形成二苯乙烯。在某些情况下，同源酶在不同的途径中利用不同的底物催化相似的反应。来自NTF2家族的两个酶，LdpA和PcfL，催化类似的生成二苯乙烯的脱甲酰化反应，但分别使用不同的底物：β-1连接的赤式-DGPD和β-5连接的DCA-C。类似地，同源的脱羧酶PhcF/PhcG和PinX分别在β-5连接的DCA-CC和β-β连接的落叶松脂醇酸中引入双键并释放CO2。
然而，在其他例子中，不相关的酶在相关底物上执行相似的转化。在DCA分解代谢中，二苯乙烯的形成可以由立体选择性的PhcF/PhcG脱羧酶催化，也可以由非立体特异性的NTF2家族脱甲酰酶PcfL和谷胱甘肽S-转移酶LigE催化。虽然反应化学的细节有所不同，但这三种情况都可能形成醌甲基化物中间体。类似的替代方案是否存在于其他途径中仍有待观察。例如，由PinXY催化的落叶松脂醇转化为伊菠蓝烯的反应与PhcCDFG催化的反应相似，理论上可能被PcfL的同源物所取代。同样，已提出LdpA与赤式-DGPD的反应以及PinVW与伊菠蓝烯的反应都涉及醌甲基化物中间体。在这两种情况下，中间体都通过释放甲醛而消除，从而在芳香环之间的连接体中引入双键。然而，这两个酶的第一步半反应不同：LdpA催化脱水形成醌甲基化物中间体，而PinVW催化氧化反应。
最后，有证据表明底物混杂性简化了同化网络。例如，LigW和LigW2将DDVA分解代谢中的5-羧基香草酸脱羧为香草酸，并将DCA分解代谢中的5-羧基阿魏酸脱羧为阿魏酸。类似地，LigL和相关Cα脱氢酶氧化GGE和苏式-DGPD。木质素芪双加氧酶家族的同源酶已被证明可以裂解多种二苯乙烯中间体。这些酶家族的其他成员很可能已经进化为能够分解代谢其他木质素相关的芳香化合物。虽然这些酶的底物特异性未知，但独特同源物的数量表明了所涉及的规模。例如，SYK-6有八种木质素芪双加氧酶同源物和62种来自NTF2超家族的同源物。这些酶中的一些可能参与与木质素相关芳香化合物同化无关的途径，但无疑还有更多与木质素相关的途径有待表征。
这种酶的混杂性可能解释了上述许多生化相似性。新的酶活性被认为最常从混杂的副反应中演化而来，经历创新、扩增和分化的过程。如果一种二聚体分解代谢途径中的酶同源物能够轻易进化，以催化与不同底物的类似反应，那么由于进化而非生化因素，途径往往会遵循相似的酶促转化进程。相反，由独立进化的酶催化相似转化的趋同进化则表明，潜在的生物化学是主要驱动因素。上面总结的例子表明，这两种机制在二聚体分解代谢途径的进化中都很重要。
此外，与宿主或其他内源性生化途径的上位性相互作用可能会使途径进化产生偏差。具有高表达特定类别酶或耐受特定有毒中间体能力的菌株，可能优先演化出使用这些酶或产生这些中间体的途径。评估这最后一个因素需要额外的实验。
芳香分解代谢途径的异源表达与优化
由于已知没有细菌能够分解所有潜在的木质素相关芳香化合物，高效的生物漏斗可能需要在单一生产宿主中组装多个异源途径。除了对改进木质素高值化有价值之外，异源途径表达还提供了一个直接测试有关分解代谢途径组装假说的机会。如果途径组装主要受进化偶然性和生化可行性的驱动，那么途径在不同的遗传背景下应该同样有效。反之，如果上位性相互作用是主要因素，那么某些宿主/途径组合将更具生产力。
然而，目前还很难得出结论，因为相对较少的木质素相关芳香化合物的分解代谢途径在任何异源宿主中表达过，并且通常一次只测试一条途径。完整的赤式-DGPD分解代谢途径已成功从F199转移到KT2440。KT2440天然分解香草醛，因此表达LdpA和LsdA就足以将DGPD化学计量地转化为香草醛。在这个例子中，生成的香草醛最终被转化为生物产品——顺，顺-粘康酸，而不是直接用作生长底物。另外，虽然本文未重点讨论，但DDVA分解代谢途径的一部分已从SYK-6转移到KT2440。异源表达LigXacd、LigY、LigZ、DdvK和DdvT能够以约30%的产率将DDVA转化为5-羧基香草酸。
直接比较途径在天然和异源宿主中的功能难以解释，因为天然宿主先前已经进化以优化途径功能。同样，使用异源途径实现有效生长通常需要通过实验进化来优化活性或表达。例如，F199中内源的GGE分解代谢途径也通过实验进化进行了优化。以GGE为唯一碳源进行连续传代，鉴定出几个提高生长产量的突变，主要是通过解除对天然途径的调控，这些途径可能在实验室条件下未被诱导。同时表达多个途径可能需要额外的工程化来提高途径的模块化和可移植性，最大限度地减少共表达的异源途径之间以及途径与宿主生物体之间的相互作用。
因此，大多数工程化工作都集中在转移芳香单体的同化途径上。这些努力提供了有用的经验教训，可以为研究二聚体分解代谢途径提供参考。例如，已分别在KT2440或相关菌株中独立表达了两种愈创木酚分解代谢途径：来自Amycolatopsis sp. ATCC 39116的细胞色素P450单加氧酶GcoAB或来自Rhodococcus rhodochrous J3的同源物，以及来自Cupriavidus necator N-1的Rieske型单加氧酶GdmAB。由于KT2440天然分解儿茶酚，因此仅表达愈创木酚去甲基化酶就足以使其生长。GcoAB首先在Acinetobacter baylyi ADP1中表达。对所得菌株进行连续传代，筛选出了儿茶酚双加氧酶CatA与愈创木酚去甲基化酶GcoA的融合蛋白。在染色体上表达这种融合蛋白（而非未融合的酶）使得KT2440能够以愈创木酚作为唯一碳源生长。类似地，在P. putida EM42中于中等拷贝数质粒上表达来自R. rhodochrous的GcoA同源物，也能使其以愈创木酚为唯一生长底物生长，尽管存在较长的滞后期。相反，在KT2440染色体上表达GdmAB使其能够快速利用愈创木酚生长，这可能是由于该宿主能更有效地生产Rieske型单加氧酶。对于只有一条已知分解代谢途径的二聚体，额外的生物勘探可能会识别出更易于转移的途径，例如那些有水平基因转移证据的途径。
类似地，已描述了两种不相关的香草酸O-去甲基化途径，分别以来自KT2440的Rieske型单加氧酶VanAB和来自SYK-6的四氢叶酸依赖性甲基转移酶LigM为例。当用LigM取代KT2440中的VanAB时，需要共表达MetF和LigH以增强四氢叶酸循环，并且宿主还需要一个可能也影响单碳代谢的突变，才能实现以香草酸生长。对表达LigM的KT2440进行进一步的实验进化进一步改善了生长，但优化后的表达VanAB的菌株表现优于优化后的表达LigM的菌株。理解异源途径与内源途径之间的相互作用可以实现更好的途径选择和更直接的组合代谢网络设计。
原儿茶酸同化的异源途径已在KT2440和大肠杆菌（E. coli）中表达。在KT2440中，天然的原儿茶酸3,4-裂解途径被来自SYK-6的七基因4,5-裂解途径所取代。这种异源途径具有活性，可用于提高目标生物产品的产量，尽管直接比较生长情况难以评估。同样，来自KT2440的3,4-裂解途径已转移到大肠杆菌中。在染色体上表达九基因的pca途径足以使其以原儿茶酸生长。然而，以原儿茶酸进行的实验进化发现了额外的突变，这些突变增加了原儿茶酸双加氧酶PcaH的表达以及利用原儿茶酸生长的速率。使用这种改进的菌株，表达来自A. baylyi ADP1的hcaABC途径或来自R. jostii的couLMNO途径，并结合进一步的实验进化，足以使其以香豆酸作为唯一生长底物生长。通过实验进化鉴定的额外突变包括对异源和内源基因的突变，表明异源途径的表达可以对表达宿主施加新的压力，例如，通过抑制一种必需的内源生物合成酶。随着在生产宿主中表达更多的途径，这些有害的相互作用可能会成倍增加，需要加以缓解才能实现高生产率。
结论与未来方向
木质素分解代谢被认为大约在3亿年前进化出来，这为途径进化提供了充足的时间。也许不足为奇，为了同化木质素相关的芳香化合物，已经独立进化出了多种生化途径，例如SYK-6和F199在DCA分解代谢中使用不同酶，以及LY和SG-MS2在松脂醇分解代谢中使用不相关的途径。类似地，对于芳香单体如原儿茶酸、儿茶酚、愈创木酚和香草酸的分解代谢，也发现了独立进化的酶和途径。最近的发现表明，即使对于像DCA和松脂醇这样研究得比较充分的底物，仍然有待发现更多的途径。表征这些途径并理解其中的权衡取舍，将进一步阐明芳香寡聚体分解代谢的潜在生化逻辑，并为细菌代谢工程进行木质素高值化提供额外的酶学资源。例如，生物信息学证据表明，一些细菌可能具有平行的DCA分解代谢途径，同时使用PhcF/PhcG和PcfL的同源物。如果这些平行途径被证实，那么在什么情况下冗余会比单一途径更具优势？
上述许多途径发现工作考虑了二聚体立体化学的作用，但主要关注具有两个愈创木基（G）部分的二聚体。然而，许多木质素降解产物可能含有羟基肉桂酰基（H）和紫丁香基（S）部分。已对一些相关底物进行了特定反应的测试。通常，对二聚体降解途径的分析受到合适模型化合物可用性的限制，而具有不同单体和确定立体化学的二聚体则更具合成或商业采购挑战。增加不同模型二聚体的可用性，将能够更全面地分析芳香分解代谢酶的底物混杂性，从而识别缺失的反应，推动进一步的发现。
最后，用于复杂同化途径的代谢工程仍处于早期阶段，主要体现在转移短途径以同化单体芳香化合物。对具有优化途径组合的菌株进行工程化，特别是对于多基因的寡聚体同化途径，将需要新的途径调控技术来最小化有害的相互作用，以及需要途径优化来缓解那些仍然存在的相互作用。目前尚不清楚同化途径之间的相互作用在多大程度上是有益的还是有害的。如果它们通常是有益的，那么像SYK-6或F199这样天然含有多种芳香寡聚体同化途径的菌株，将是进一步工程化的良好宿主。反之，如果相互作用是有害的，那么组装一个由专门菌株组成的群落将更具优势。需要更多的研究来确定最佳的前进道路。
