通过c-di-GMP调控对氧化亚铁硫杆菌进行生物膜工程改造以提升生物浸出效率与砷耐受性
研究背景与目标
生物浸出是一种利用微生物从低品位矿石和尾矿中提取有价金属的可持续生物技术，但其工业应用受到浸出率低、重金属抑制以及微生物适应期长等关键限制。氧化亚铁硫杆菌是生物浸出过程中的模型微生物，但其活性在工业环境中常受高浓度重金属（如砷）的抑制。生物被膜的形成有助于缓解这些限制，但如何有效调控生物被膜以同时提升浸出效率和胁迫耐受性仍具挑战。环二鸟苷酸作为一种保守的细菌第二信使，是调控生物被膜形成和功能的全局性开关分子。本研究旨在通过调控氧化亚铁硫杆菌 中的c-di-GMP水平，定向改造其生物被膜，以同步增强其生物浸出性能和砷胁迫耐受性。
工程菌株构建与c-di-GMP水平测定
研究选取了氧化亚铁硫杆菌 ATCC 23270野生型菌株作为出发菌株。研究人员构建了基于pYDT质粒的表达载体，并分别克隆了来自氧化亚铁硫杆菌 本身的三个内源二鸟苷酸环化酶基因（AFE_1379 ， AFE_0053 ， AFE_1373 ）以及来自大肠杆菌的一个外源DGC基因（yedQ ）。通过接合转移将这些重组质粒导入宿主，成功构建了工程菌株S-222（表达AFE_1379 ）、S-306（表达AFE_0053 ）、S-651（表达AFE_1373 ）和S-149（表达yedQ ），并以携带空载质粒pYDT的菌株S-137作为对照。
对工程菌株的检测显示，在无砷条件下，所有工程菌株的生长曲线相似，表明质粒转化和基因过表达本身未对细菌基础生长造成显著影响。然而，它们的细胞内c-di-GMP水平存在显著差异。菌株S-149的c-di-GMP水平与对照S-137相近。而过表达内源DGC基因的菌株S-222、S-306和S-651的细胞内c-di-GMP水平分别提升至对照的约1.7倍、2.5倍和5倍，具体为221.5 ± 27.3， 306.3 ± 28.1， 和 651.4 ± 15.5 µg mg-1 总蛋白，呈现出AFE_1373 > AFE_0053 > AFE_1379 的提升效果。在5 mM砷胁迫下，各菌株的c-di-GMP水平仅有轻微且不显著的变化，相对顺序保持不变。
生物浸出性能评估
研究以黄铁矿为底物，系统评估了工程菌株在有无砷胁迫下的生物浸出性能。在无砷条件下，所有菌株的铁释放动力学均呈S型曲线，经历滞后期后进入快速氧化阶段。菌株S-306表现出最高的铁释放速率，为1.21 ± 0.06 mM day-1 ，是对照菌株的1.6倍，也显著高于S-651和S-222。硫酸盐生成速率也呈现相同趋势。这表明在无砷条件下，生物浸出能力并非随c-di-GMP水平单调递增，中等c-di-GMP水平的S-306性能最优。
在5 mM砷酸钠胁迫下，生物浸出性能排序发生变化。此时，c-di-GMP水平最高的S-651成为浸出效率最高的菌株，其铁释放速率为0.61 ± 0.01 mM day-1 ，是对照菌株的1.7倍。尽管相较于无砷条件其浸出率下降了约37%，但其最终的铁浸出总量基本保持不变。而其他菌株在砷胁迫下受到的抑制更为严重，浸出速率和总量均显著下降。实验结束后对固相和液相中砷的分析表明，S-651体系中固相关联态砷的比例最高（达50%），显著促进了砷的固定化。同步辐射X射线衍射分析进一步揭示，砷胁迫实验后的固体产物主要为臭葱石，而无砷条件下主要为黄钾铁矾。S-651因其更高的生长速率和浸出性能，能更快地释放Fe3+ ，从而加速臭葱石沉淀，降低溶解态砷浓度，缓解砷毒性，展现出优异的砷耐受性。
工程菌株生物被膜特性差异
研究进一步通过共聚焦激光扫描显微镜、生物化学分析和电化学阻抗谱等手段，深入比较了工程菌株在黄铁矿表面形成的生物被膜特性。
在无砷条件下，所有工程菌株的生物被膜中活细胞比例相近（约65%）。生物被膜总生物量（以总蛋白含量和CLSM图像灰度值评估）的顺序为：S-306 > S-651 > S-222 > S-149 ≈ S-137。其中，S-306的生物被膜最厚，总蛋白含量最高。
在砷胁迫下，对照及其他多数工程菌株的生物被膜中活细胞比例显著下降至44–47%，表明砷毒性严重损害了其代谢活性。然而，S-651菌株在砷胁迫下仍保持了59%的活细胞比例，显示出更强的胁迫抗性。此时，生物被膜总生物量的顺序变为：S-651 > S-306 > S-222 > S-149 ≈ S-137。值得注意的是，S-651的生物被膜蛋白含量在有砷和无砷条件下几乎不变，表现出卓越的稳定性。
胞外多糖含量分析显示，过表达内源DGC基因的菌株，其生物被膜中胞外多糖荧光信号和化学检测含量均增加。尤其在砷胁迫下，S-651的生物被膜具有最高的胞外多糖含量，是对照菌株的3.2倍，是S-306的2.2倍。傅里叶变换红外光谱证实S-651的胞外聚合物（EPS）中含有更丰富的多糖键、羟基和羧基/酰胺基等砷结合官能团。相应的砷吸附实验表明，S-651的EPS对砷的平衡吸附容量也最高，分别是对照和S-306的2.2倍和1.4倍。这表明S-651生物被膜中丰富的胞外多糖通过吸附作用有效固定了砷，形成了抵御砷毒性的物理化学屏障。
相反，在无砷条件下表现最佳的S-306菌株，其生物被膜的特征是富含c型细胞色素。紫外-可见光谱显示，其生物被膜裂解液在320–330 nm和410–420 nm处具有更强的特征吸收峰，表明c-Cyts含量更高。c-Cyts在氧化亚铁硫杆菌 的胞外电子传递中起关键作用。电化学阻抗谱分析进一步证实，S-306生物被膜的内部电阻显著低于其他菌株，表明其具有更优的电子传递效率。这解释了S-306在无砷条件下更高的黄铁矿氧化能力。
生物被膜细胞的基因表达谱分析
为了从分子机制上阐释表型差异，研究对生物浸出实验高峰期（第30天）的生物被膜细胞进行了转录组学和定量PCR分析。
转录组数据显示，差异表达基因的数量与菌株c-di-GMP水平正相关。S-306和S-651的基因表达谱存在显著分野。S-306菌株中，与胞外电子传递相关的关键c型细胞色素基因（如cyc1 ， rus ， cyc2 等）以及菌毛生物合成基因（如AFE_0091 ， pilB 等）表达上调最为显著。定量PCR结果证实，这些基因在S-306中的表达水平是S-651的1.1至1.8倍。这与S-306生物被膜富含c-Cyts和导电性更好的结果一致，也与其更强的黄铁矿附着和定殖能力相符。
而在S-651菌株中，多糖生物合成相关基因（如rfbD ， rfbA ， galU 等）的表达上调最为突出。定量PCR显示，这些基因在S-651中的表达水平是S-306的1.5至3.1倍。值得注意的是，所有菌株的砷抗性相关基因在砷暴露后均未表现出差异表达。这表明S-651优异的砷耐受性并非源于砷解毒基因的上调，而是主要得益于胞外多糖产量的增加，后者作为屏障限制了砷的进入和毒性。
c-di-GMP调控生物被膜基质、浸出性能及砷抗性的机制
本研究揭示了c-di-GMP水平精准调控氧化亚铁硫杆菌 生物被膜基质组成，从而适应不同环境需求的双重策略。
在无砷条件下，中等c-di-GMP水平的S-306菌株形成了富含c型细胞色素和菌毛的生物被膜。c-Cyts的提升增强了生物被膜从黄铁矿摄取电子的效率，为卡尔文循环等耗能过程提供了更多能量。同时，菌毛基因的上调促进了细菌在矿物表面的附着和生物被膜增厚。两者的协同作用使得S-306在无砷条件下具有最优的生物浸出性能。
而在高c-di-GMP水平的S-651菌株中，细胞资源更多地被导向胞外多糖的合成。虽然多糖有助于细菌附着和生物被膜形成，但其本身不导电，高比例的多糖反而增加了生物被膜的内部电阻，阻碍了电子传递，因此在无砷条件下其浸出性能次于S-306。
然而，在砷胁迫环境中，S-651生物被膜中丰富的胞外多糖发挥了关键作用。它们通过吸附作用固定溶解态砷（固持率约50%），并促进臭葱石沉淀，有效降低了细胞周围的砷毒性，从而维持了较高的细胞活性和生长速率。尽管其浸出速率因电子传递受阻而有所下降，但仍显著优于其他受砷严重抑制的菌株，实现了生物浸出效率与砷耐受性的良好平衡。
结论与展望
本研究通过调控c-di-GMP信号通路，成功对氧化亚铁硫杆菌 进行了生物被膜工程改造，实现了根据环境需求（有无重金属胁迫）可调谐地优化其功能。该工作表明，c-di-GMP作为一种上游全局调控分子，能够通过重编程生物被膜基质组成（蛋白质与多糖的比例），同时应对生物浸出中的多个瓶颈问题，即低浸出效率和重金属抑制。
从应用角度看，富含细胞色素的生物被膜（如S-306）可优先用于从低品位硫化矿或尾矿中高效回收金属。而富含多糖的生物被膜（如S-651）则在砷等重金属污染严重的浸出环境或需要生物修复的污染场地中更具优势。这为开发场景定制的工程菌株提供了明确指导：在重金属压力下，应聚焦于修饰多糖合成相关基因；在无金属环境中，则可通过过表达EET相关c-Cyts和菌毛生物合成基因来提升浸出效率。
未来，可通过使用诱导型启动子控制单一DGC基因的表达，定量研究c-di-GMP水平与生物被膜性状及浸出性能之间的剂量关系。这一策略也可拓展至氧化亚铁硫杆菌 介导的其他重金属富集工业过程，如从电子废物中回收贵金属、废电池生物精炼以及污染场地修复等。该研究架起了微生物生理调控、环境适应与应用生物技术之间的桥梁，为推进采矿及更广泛工业背景下的可持续金属回收和环境修复提供了新框架。
打赏
