1 Introduction
近年来，近红外（NIR）发光材料因其出色的深层组织穿透能力、快速响应速度和低背景干扰，在传感器、生物成像、疾病诊疗和光催化生物正交化学等领域应用广泛。然而，传统的NIR发光材料通常面临诸多挑战，如繁琐的化学合成与发色团修饰、低量子效率以及热猝灭。利用环糊精、柱芳烃和葫芦脲等超分子大环主体封装NIR发色团，已被证实是改善NIR发光材料光物理性质的有效策略。此外，基于荧光/磷光共振能量转移（FRET/PRET）的人工光捕获系统，能将能量从激发单重态/三重态的供体发射体转移到发色团受体的单重态，被认为是将发射扩展到NIR区域的一种引人注目的方案。然而，除了光谱重叠外，实现FRET/PRET还需要供体/受体的空间邻近性以及合适的跃迁偶极矩取向。在这方面，大环限域和超分子级联组装不仅可以通过限制分子运动来抑制非辐射跃迁导致的能量损失，从而促进磷光的产生，还能使能量供体和受体在空间上更接近并稳定单重态/三重态激子，从而增强FRET/PRET的可能性。尽管通过FRET构建近红外发光材料已取得实质性进展，但大多数基于供体-受体掺杂的异质系统存在诸如能量转移距离不利、信噪比差以及稳定性令人担忧等缺点。而具有单一电子供体/受体对的单分子荧光共振能量转移，其转移效率直接由分子内供体-受体距离和偶极取向决定，表现出灵敏且稳定的信号以及强大的抗干扰能力，在先进NIR材料设计中广受欢迎。然而，据我们所知，通过多级大环限域在电荷转移复合物中实现NIR延迟荧光发射，并通过电荷转移相互作用调控PRET过程的单分子磷光共振能量转移则鲜有报道。
在本工作中，我们报道了一种基于多级大环限域的高效单分子PRET系统，该系统由刚性二苄基桥连的吡啶盐衍生物（G1）、葫芦[8]脲（CB[8]）和β-环糊精（β-CD）修饰的透明质酸（HACD）构建而成，具有320 nm的大斯托克斯位移和NIR延迟荧光发射，可用于靶向癌细胞成像。得益于葫芦[8]脲的限域效应有效促进了系间窜越过程并抑制了分子振动和猝灭剂引起的非辐射跃迁，CB[8]和G1的二元组装激活了溴苯基吡啶单元在约500 nm处的强烈磷光发射。通过与HACD进一步组装，利用β-CD对蒽基的限域效应以及与HA的静电相互作用，实现了从苯基吡啶单元到蒽基吡啶部分的分子内PRET过程，同时伴随着拓扑形态从纳米棒向囊泡的转变，具有良好的细胞渗透性，最终在650 nm处产生寿命为11.20 µs的NIR延迟荧光。利用HACD的肿瘤靶向特性，这种具有大斯托克斯位移和长寿命NIR光致发光的三元超分子组装体成功应用于癌细胞的线粒体靶向成像。
2 Results and Discussion
G1通过两步Mizoroki-Heck反应/烷基取代反应合成，并通过核磁共振（1H NMR, 13C NMR）和高分辨率质谱充分表征。首先，进行紫外-可见（UV-vis）滴定实验以研究G1与CB[8]之间的结合行为。随着CB[8]的加入，G1的紫外-可见光谱显示出其从467 nm到518 nm的特征电荷转移吸收持续红移，并在加入1.0当量CB[8]后趋于稳定，表明G1以1:1的化学计量比被封装到CB[8]的空腔中，并且由于CB[8]的稳定作用，蒽基作为供体与吡啶盐作为受体之间的电荷转移相互作用显著增强。G1与CB[8]之间1:1的化学计量结合比通过Job's plot实验得到证实，并且根据通过非线性最小二乘公式拟合的紫外-可见吸收滴定，确定结合常数为5.49 × 106M−1。此外，进行了1H NMR和2D NMR光谱分析以推断G1和CB[8]之间的结合模式。1H NMR谱显示，蒽基吡啶盐上的质子（α’ 和 β’）几乎发生了显著的低场位移，而溴苯基吡啶盐上的质子（α 和 β）则向高场位移，表明曲折的G1倾向于以头对尾的结合模式，通过CB[8]空腔对溴苯基吡啶单元进行末端封装。同时，客体分子G1的扩散系数（D = 2.66 × 10−10m/s2）比组装体G1/CB[8]（D = 9.37 × 10−11m/s2）大一个数量级，这进一步验证了G1/CB[8]形成了n:n头对尾超分子准轮烷。相应地，采用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）来揭示主客体络合后拓扑结构的变化。游离的客体分子G1呈现出长度约为3 µm的螺旋纳米纤维，这可能归因于分子间电荷转移相互作用驱动的随机自组装。相比之下，CB[8]的加入将G1的纤维状拓扑结构转变为长度在200-1000 nm不等的纳米棒，这与准轮烷的有序头对尾组装模式一致。
在充分表征G1和G1/CB[8]之后，探索了它们的光致发光性质。G1在470 nm激发下显示出650 nm的荧光发射，在延迟光谱中没有捕获到明显的磷光信号。加入1.0当量的CB[8]后，650 nm处的荧光发射峰增强，并且在延迟光谱中，在330 nm激发下，500 nm处出现发射峰信号，这对应于CB[8]对溴苯基吡啶单元的限域效应以及由线性刚性层层组装形成的超分子纳米结构对三重态猝灭剂的有效屏蔽作用。由于G1中的两个组分（溴苯基吡啶单元和蒽基吡啶单元）分别在330 nm和470 nm激发下出现500 nm的磷光发射和650 nm的荧光发射，从而满足了供体和受体之间光谱充分重叠的要求，我们探索了单分子磷光能量共振转移体系的构建。首先，合成了参考化合物BrPY和BP4VA-1，通过简单地物理混合能量供体和受体来研究磷光行为。由于CB[8]对客体的限域效应促进了系间窜越过程并抑制了非辐射跃迁，参考分子BrPY在与CB[8]组装后，在500 nm附近显示出强烈的室温磷光（RTP）发射，寿命为372.26 µs。由470 nm激发的BP4VA-1的稳态光致发光（PL）谱显示在650 nm处有一个发射峰，测量的纳秒寿命为0.55 ns，揭示了蒽基吡啶单元的纯荧光特性。当供体/受体比例从20:1增加到1:1时，受体在650 nm处的NIR延迟荧光发射强度逐渐增强，而500 nm处的磷光寿命从171.02 µs减少到25.69 µs，暗示了BrPY/CB[8]与BP4VA-1之间的PRET过程。然而，在330 nm激发下，G1/CB[8]未能表现出650 nm的延迟荧光发射。
为了实现单分子磷光共振能量转移并提高生物成像的生物相容性，引入了β-环糊精接枝的透明质酸（HACD）与G1/CB[8]构建三元超分子组装体。利用HA的高负电荷密度以及接枝的β-CD通过疏水效应对芳基进行封装，我们假设在二次组装后进一步限制主客体复合物可以抑制非辐射跃迁，并使能量供体和受体在空间上更接近，从而增强发生PRET过程的可能性。正如预期的那样，随着向G1/CB[8]溶液中加入HACD，500 nm处的磷光发射逐渐减弱，同时延迟光谱中在650 nm处出现了一个新的发射峰，并在HACD含量为0.045 mg/mL时趋于稳定。在确定了HACD的最佳含量（0.045 mg/mL）后，我们探索了G1/CB[8]@HACD的二次组装行为和光物理性质。G1/CB[8]@HACD的TEM图像显示其拓扑结构从纳米棒转变为囊泡，其尺寸与动态光散射（DLS）测量中752 nm的平均流体动力学直径相匹配。同时，在G1/CB[8]@HACD溶液中也观察到了明显的丁达尔效应，表明形成了超分子纳米组装体。此外，G1和G1/CB[8]具有+2.58和+3.31 mV的正zeta电位，随着HACD的加入，该电位转变为-0.135 mV，揭示了通过静电相互作用成功构建了三元超分子组装体。为了验证HACD与蒽基之间的相互作用，选择BP4VA-1和β-CD作为模型化合物，并通过1H NMR谱研究了它们的结合行为。加入β-CD后，BP4VA-1上蒽基的质子（He, Hf）向低场移动，表明蒽基单元被封装到β-CD的空腔中。此外，HACD的加入有效延长了BP4VA-1的荧光寿命，推断HACD可以稳定BP4VA-1的单重态激子，从而进一步增强了PRET的可能性。相应地，由330 nm激发的G1/CB[8]@HACD组装体在500 nm处显示出寿命为196.73 µs的磷光发射，以及在650 nm处为中心的、寿命为11.20 µs的主要发射带，这归因于通过PRET过程产生的蒽基吡啶单元的延迟荧光。然而，在450 nm激发下，G1、G1/CB[8]和G1/CB[8]@HACD均显示出650 nm的荧光发射，其寿命分别测量为0.56、0.63和0.77 ns，证实了由HACD介导的在650 nm处的NIR延迟荧光是通过PRET过程实现的，而不是通过直接激发能量受体。此外，在氮气气氛下，G1/CB[8]@HACD水溶液在500 nm处的寿命从196.73 µs显著增加到323.73 µs，磷光发射强度增加了四倍，并且通过PRET过程在650 nm处的延迟荧光寿命也从11.2 µs增加到20.48 µs，这是由于避免了氧气引起的三重态电子猝灭。
随后，进行了时间依赖密度泛函理论（TD-DFT）计算，以进一步探索G1/CB[8]@HACD中PRET的机制。结果表明，CB[8]的限域效应稳定了耦合二聚体的激发态，导致最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）之间的能隙从4.06 eV减小到3.46 eV，并且低能吸收带发生红移，这与实验光谱结果一致。值得注意的是，在与G1/CB[8]组装时，用带正电荷的ε-聚赖氨酸或中性的PEG替换带负电荷的HACD均未能增强650 nm处的NIR发射，表明静电相互作用在G1/CB[8]@HACD的实际结构中起着至关重要的作用，并促进了单分子PRET。此外，透明质酸酶对HACD的降解可以诱导G1/CB[8]@HACD的解组装，拓扑结构从囊泡转变回纳米棒，从而实现了单分子PRET的动态调控。随着与透明质酸酶共孵育时间的增加，G1/CB[8]@HACD在650 nm处的延迟荧光信号显著下降。同时，500 nm处的磷光发射呈现出初始恢复和随后下降的特征趋势，这可能归因于透明质酸酶对G1/CB[8]@HACD的初步降解导致染料分子从超分子组装体中释放，从而废除了PRET过程，进而恢复了磷光信号。然而，HACD的进一步酶降解解除了对G1/CB[8]的二次限域效应，导致磷光强度随后下降。与商业NIR染料和最先进的用于NIR生物成像的PRET系统相比，G1/CB[8]@HACD表现出可观的量子产率、NIR发光的长寿命以及出色的光稳定性，使其成为近红外延迟荧光成像的有前途的候选者。
考虑到通过PRET构建的三元纳米超分子组装体G1/CB[8]@HACD具有良好的NIR延迟荧光发射特性，并且可以被肿瘤细胞上过表达的HA受体识别，我们探索了其在肿瘤靶向生物成像中的应用。分别用G1/CB[8]@HACD处理人肺癌细胞（A549细胞）和人胚胎肾细胞（293T细胞）12小时，然后与Hoechst和Mito-Tracker Green或Lyso-Tracker Green一起孵育进行定位实验。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察G1/CB[8]@HACD在细胞器中的分布。A549细胞显示出明亮的NIR发射，对应于G1/CB[8]@HACD的延迟荧光，而在正常的293T细胞的NIR通道中几乎没有发现信号，这表明G1/CB[8]@HACD通过HA受体介导的内吞作用优先内化到癌细胞中，而不是正常细胞中。此外，NIR发光信号与Mito-Tracker Green的信号重叠良好，相应地计算出的Pearson相关系数为78%，揭示了G1/CB[8]@HACD在癌细胞中进行靶向线粒体成像的能力。此外，通过CCK-8测定试剂盒评估了细胞毒性，结果表明，在孵育24小时后，A549细胞和293T细胞的细胞活力均保持在90%以上，证明了G1/CB[8]@HACD具有优异的生物相容性。受到G1/CB[8]@HACD在细胞水平上出色的线粒体靶向NIR成像能力的鼓舞，进行了体内成像以进一步评估其临床转化潜力。动物使用和实验程序获得了南开大学动物实验伦理委员会的批准，所有实验方案和操作程序均按照相关指南进行。通过尾静脉注射将G1/CB[8]@HACD（100 µM，0.13 mL）给予荷有A549的BALB/c裸鼠，并在孵育12小时后通过体内成像系统（IVIS）评估其分布。G1/CB[8]@HACD集中在肿瘤组织中，这可能归因于其合适的尺寸以及其被肿瘤表面丰富的HA受体识别而产生的增强渗透性和滞留效应（EPR）。
3 Conclusion
总之，我们通过CB[8]的大环限域和HACD的二次组装，成功构建了一种单分子PRET系统，实现了NIR延迟荧光发射，用于靶向细胞成像。PRET系统中供体和受体之间的刚性二苄基连接体允许与CB[8]形成反平行堆积模式，从而形成分子间电荷转移阵列，实现了G1从纳米纤维到纳米棒，然后随着CB[8]和HACD的逐步加入转变为囊泡的拓扑转变。同时，三元超分子组装体G1/CB[8]@HACD独特的自组装模式通过多级限域效应促进了从溴苯基吡啶到蒽基吡啶的单分子PRET，将500 nm的磷光发射转换为650 nm的NIR延迟荧光发射，寿命为11.20 µs。此外，这种多级限域激活的单分子PRET系统显示出320 nm的大斯托克斯位移，并成功应用于线粒体靶向肿瘤细胞成像，且细胞毒性可忽略不计，这为构建单分子PRET系统提供了便捷的途径，并对功能化NIR发光材料的发展具有潜力。
