肾小球疾病中补体成分的蛋白质组学分析

本研究利用数据独立采集质谱技术，系统评估肾活检组织中补体系统蛋白及其激活产物的表达水平，发现补体终末共同通路蛋白在糖尿病肾小球硬化症和增殖性肾小球肾炎中的异质性，并证实补体C1q免疫荧光强度与质谱检测的补体蛋白丰度显著相关，为精准医学治疗提供新靶点。

亚伦·斯托里（Aaron Storey）| 蒂芙尼·卡扎（Tiffany Caza）| 萨马尔·哈桑（Samar Hassen）| 瑞克·埃德蒙森（Rick Edmondson）| 克里斯蒂安·赫尔佐格（Christian Herzog）| 约翰·阿瑟（John Arthur）| 克里斯托弗·拉尔森（Christopher Larsen）

阿卡纳实验室（Arkana Laboratories），阿肯色州小石城（Little Rock, Arkansas）

摘要

补体系统在肾小球疾病的发展和消退过程中起着核心作用。目前，肾活检主要通过有限的免疫荧光染色（C3和C1q）来评估补体的存在。由于补体级联反应涉及超过50种蛋白质和片段，这种方法的视角严重受限，无法充分了解补体激活所引发的组织损伤机制。通过质谱技术实现补体成分的全面评估，可以多重检测补体级联反应中的蛋白质及其活化产物，从而加深对补体在肾小球疾病中作用的理解。数据独立的质谱分析是在从组织裂解物、显微切割的肾小球或剩余肾活检组织中提取蛋白质后进行的。研究对象包括狼疮性肾炎、膜性肾病、糖尿病性肾小球硬化症、C3肾小球肾炎患者以及对照组。质谱分析结果显示，补体成分的丰度与肾活检样本中C1q的免疫荧光强度相关。在狼疮性肾炎患者中，经典补体途径、凝集素途径和最终共同途径相关蛋白的丰度增加与疾病活动度呈正相关。即使是同一疾病状态的患者，其补体成分的丰度也存在差异（例如糖尿病性肾小球硬化症和不同类型的增生性肾小球肾炎）。总之，质谱技术可以可靠地测量肾活检样本中的补体蛋白及其活化产物，有助于我们更好地理解补体介导的组织损伤及其在肾小球疾病中的异质性。

引言

补体激活是多种肾小球疾病发病机制的基础，也是这些疾病持续进展的关键因素。在多种肾小球疾病中，补体激活及其活化产物的沉积会加剧肾小球损伤。补体功能障碍是C3肾小球病（C3GN）、IgA肾病（IgAN）、ANCA相关性肾小球肾炎（ANCA-associated GN）、狼疮性肾炎（LN）、膜性肾病（MN）等多种肾脏疾病的发病机制中的关键因素。详细分析经典补体途径、凝集素途径或替代补体途径的失调情况，有助于开发新的诊断方法，识别可能从补体靶向治疗中受益的患者，并推动精准医疗的发展。

补体抑制是肾小球肾炎的治疗靶点，因为补体激活通过多种机制导致肾小球损伤。经典补体途径中的C3a和C5a会吸引中性粒细胞和巨噬细胞，通过焦亡诱导炎症细胞死亡（21, 22），触发细胞因子释放，并增加共刺激分子的表达，从而加剧免疫反应（23）。最终共同途径的激活还会直接损伤细胞膜（24）。补体激活会增加肾小球内的免疫复合物沉积（25），并损害肾小球滤过屏障功能（26）。长期补体激活会导致不可逆的纤维化（27, 28）。因此，减少补体激活对于缓解疾病至关重要，是当前的研究重点。

目前，补体活性的检测主要在血液中进行，而非直接在肾组织内进行。C3和C4水平与多种肾小球肾炎（如LN、ANCA相关性GN、C3GN、IgAN等）的疾病活动度相关。然而，肾小球内的补体沉积及其分解产物能更准确地反映补体激活的程度及疾病的严重程度。虽然免疫荧光染色是肾活检的标准检测方法（37），但它对补体成分的表征有限，且无法准确反映补体的实际活性（38）。

活检样本中的补体谱型不仅有助于评估疾病活动度，还有潜力预测对补体靶向治疗的反应。补体激活及其活化产物的沉积会导致肾小球损伤。补体在肾小球内的积聚可能比免疫复合物的沉积更具破坏性，因为补体激活会引发进一步的放大效应，进一步增加肾小球内的沉积（39）。

对肾小球内补体蛋白的蛋白质组学分析有助于揭示补体激活与调节途径之间的复杂相互作用。通过质谱技术进行补体谱型分析，不仅能加深我们对疾病的理解，还能评估补体激活的模式。在少数肾小球肾炎患者中进行的激光捕获显微切割（LCMD）结合质谱分析发现，LN患者以C4B为主导的免疫反应，而IgAN和ANCA相关性GN及C3GN患者则表现为替代补体途径激活（39）。这些初步研究表明，质谱技术可用于测量肾小球内的补体成分，为后续研究提供了理论基础。

材料与方法

研究队列。经阿卡纳实验室（Arkana Laboratories）机构审查委员会批准后，从活检数据库中选取了患有各种肾脏疾病的患者的肾活检样本。样本的选择标准包括组织充足性（≥10个肾小球、<50%的肾小球硬化、<50%的肾小管间质纤维化）以及无免疫抑制药物使用史。由于测量具有半定量性质，需要在各组间进行内部标准化处理，因此涉及多个疾病队列。

DIA-MS对补体成分测量的深度和广度

DIA-MS相比DDA-MS的一个显著优势是数据集中所有样本的蛋白质定量值缺失情况较少。从气相部分注射中检测到的肽类，并被纳入经验校正的数据库后，通常能在大部分或所有样本中得到定量结果。获得每个补体蛋白在所有样本中的完整定量谱型对于发现疾病状态间的差异至关重要。

局限性

发现蛋白质组学实验通过无偏的肽量评估提供了对生物化学系统的深入见解，但这些测量结果以相对丰度的形式呈现，难以在不同实验间进行比较。因此，上述研究队列的数据无法合并进行统一分析。这是因为DIA-MS运行过程中可能存在批次效应，某些肽在某些实验中被检测到而在其他实验中未被检测到，从而导致数据缺失。

未来方向

在“真实世界”样本中进行的功能测试将验证肾小球内的补体测量是否真正反映了疾病活动度，例如，使用依库珠单抗（eculizumab）治疗的患者中C5（及最终补体途径成分）的抑制是否与肾小球内这些蛋白的丰度相关。然而，这需要治疗前后的肾活检样本，而临床实践中通常不进行此类检测。

补体研究的另一个未来方向是……

讨论

质谱技术作为一种重要的辅助检测方法，能够提高诊断的准确性，并从肾活检中获取比单纯形态学评估更多的信息，补体谱型分析也不例外。目前基于组织的蛋白质组学研究主要集中在根据特定蛋白质的富集情况来确定疾病的亚型。例如，在淀粉样变性病例中，该技术最初被用于识别淀粉样蛋白的类型。

未引用的参考文献

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