摘要
自从为打击滥用重组促红细胞生成素( rEPO )而实施首个EPO检测方法以来，相关技术和鉴定标准不断发展。等电聚焦( IEF-PAGE )是最早用于根据电荷分离EPO亚型的技术，如今仍可用于初筛，但决定性确认rEPO存在的方法已主要被基于分子量的电泳分离( SDS-PAGE或SAR-PAGE )所取代。近期，在家族性红细胞增多症患者的EPO 基因非编码区发现了不同突变。这些患者的血液EPO经IEF-PAGE分析后呈现高碱性谱，与rEPO所在的区域相同。为避免在反兴奋剂背景下可能的误判，本研究旨在使用反兴奋剂实验室授权的所有方法( IEF-PAGE、SDS-PAGE和SAR-PAGE )来表征这些患者的尿液和血液EPO谱，并将其与野生型( WT ) EPO以及给予rEPO Eprex后获得的谱进行比较。结果表明，与WT EPO相比，患者的SDS-PAGE和SAR-PAGE谱未发生改变，不会误认为存在rEPO。相比之下，尿液中的IEF-PAGE谱比血液中稍偏酸性，更接近rEPO谱，但它们并不满足当初仅使用IEF-PAGE作为授权方法时的鉴定标准。这些目前仅在红细胞增多症患者中发现的EPO 突变，导致不良分析结果的可能性极低。
1 引言
促红细胞生成素( EPO )是一种调节红细胞稳态和人体适应氧气供应变化的关键激素。其生产在出生后不久从胎儿期的主要生产器官肝脏转移到肾脏。一旦进入循环，EPO通过与多种细胞类型膜上表达的受体( EPOR )结合发挥多效性作用。其促红细胞生成活性源于对骨髓中红系祖细胞抗凋亡信号通路的激活。EPO是一种高度糖基化的蛋白质，含有三个天冬酰胺( N )连接的寡糖和一个丝氨酸( O )连接的寡糖(占总质量的40% )。这些糖链组成的差异，特别是唾液酸含量的差异，对EPO的循环半衰期及其与EPOR的结合亲和力起着重要作用。
哺乳动物细胞培养生产人EPO在20世纪80年代末为纠正贫血提供了一种有效疗法，但也导致了大规模的兴奋剂滥用。在世纪之交，首个用于检测尿液中rEPO兴奋剂的方法得以实施。它涉及通过等电聚焦( IEF-PAGE )进行蛋白质电泳分离。有趣的是，与尿液中检测到的内源性EPO相比，rEPO具有更碱性的谱图。这与糖基化性质的细微差异有关。然而，多年来，发现了一些内源性EPO谱图的变异来源，有时会产生更碱性的谱图，包括“活性尿液”中的细菌降解、提示肾脏过滤过程中酸性亚型选择性过滤的血液EPO谱，以及力竭性运动后观察到的“运动后尿液”。
2009年，另一种检测rEPO兴奋剂的方法得到验证和实施：它利用分子量( MW )而非等电点的差异。事实上，由于糖基化的细微变化，rEPO药物的MW略高于内源性EPO。这种SDS-PAGE或SAR-PAGE方法(取决于所使用的迁移缓冲液，含有十二烷基硫酸钠[SDS]或肌氨酸钠[SAR])在2013年被强制规定为确证分析，只要在IEF-PAGE分析后怀疑存在rEPO。今天，SDS/SAR-PAGE方法仍然是检测rEPO及第二代和第三代EPO药物兴奋剂的首选方法，尽管IEF-PAGE方法仍可作为初始测试程序或在某些情况下作为有价值的补充分析。
最近，法国反兴奋剂实验室接到一个医学研究团队的咨询，寻求关于EPO谱分析的专家意见。该团队发现了患有遗传性红细胞增多症的家庭，但这些患者体内典型的低氧通路相关基因没有突变，血液中的EPO浓度也未升高。检测到的唯一突变位于EPO 基因的非编码部分。通过SDS/SAR-PAGE分析的初步评估未发现与野生型( WT ) EPO的明显差异。然而，在IEF-PAGE分析后，这些患者的EPO谱图呈现向碱性区域的明显偏移，而重组EPO通常出现在该区域。IEF EPO谱图也比健康成人WT血液EPO谱图的亚型少。这种特殊的EPO形式与体外的EPOR信号激活更高相关，因此可能参与红细胞增多症的发展。此外，这种碱性EPO谱图与早产新生儿中观察到的EPO血液谱图高度相似，提示其可能源自肝脏而非肾脏。
为避免反兴奋剂界任何可能的混淆或误解，本工作的目标是在血液分析之外，首次使用反兴奋剂实验室目前使用的所有授权检测方法( IEF-PAGE、SDS-PAGE和SAR-PAGE )分析这些患者的尿液，并讨论所得结果的解释。
2 材料与方法
2.1 人类样本
在获得当地伦理委员会批准后，从红细胞增多症患者和Eprex给药受试者收集血液和尿液样本。
具有EPO基因非编码序列突变的家族性红细胞增多症患者由医院招募。他们提供了书面知情同意书，同意对其血液和尿液样本进行额外分析。本研究中分析的样本来自三名携带位于EPO基因主启动子c.−252C>T变体的患者和一名携带位于EPO基因内含子1的c.14-26A>G变体的患者。这些突变未引入任何蛋白质序列变化。
这些患者表现为中度至重度红细胞增多症，导致较高的血液学数值。他们每隔几个月通过静脉放血进行治疗。血液中的EPO浓度处于低至正常范围。
Eprex给药受试者：招募了六名健康志愿者，他们提供了书面知情同意书，参与在阿尔及利亚蒂济乌祖医院进行的rEPO Eprex及其生物类似物Hemax的给药研究。
所有样本均被匿名化和编码。样本在分析前于反兴奋剂实验室(LADF)在−20°C下储存。
2.2 化合物、试剂和材料
列出了研究中使用的化合物、试剂和材料，包括各种EPO标准品、缓冲液、电泳试剂、抗体和检测试剂。
2.3 EPO免疫纯化
使用与NHS活化磁珠连接的mAb抗EPO克隆9C21D11从尿液和血浆中免疫纯化EPO。尿液样本(15 mL)需要在应用到磁珠之前进行浓缩。简而言之，用3.75 M Tris/HCl缓冲液pH 7.4中和尿液，添加蛋白酶抑制剂，然后使用30 kDa截留的超滤离心过滤器进行超滤，得到浓缩至1 mL的超滤液。
将尿液浓缩液和血浆(1.0–1.2 mL)加载到磁珠上，在室温下旋转搅拌1小时。洗涤珠子，然后用洗脱缓冲液洗脱EPO。经过多个洗涤和缓冲液交换步骤后，将最终洗脱液调整至45 μL，并等分为三份(每份15 μL)，用于IEF-PAGE、SAR-PAGE和SDS-PAGE分析。
2.4 EPO分析
• SDS-PAGE ：使用最终洗脱液15 μL进行分析，补充DTT和LDS样品缓冲液。95°C变性5分钟后，将洗脱液上样至NuPAGE 10% Bis-Tris中胶孔中，使用MOPS-SDS运行缓冲液。按照先前描述的方法使用CAPS缓冲液通过不连续缓冲液转移系统将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯( PVDF )膜上。
• SAR-PAGE ：分析与SDS-PAGE完全相同，但用SAR替代样品缓冲液和电泳运行缓冲液中的SDS，并将印迹缓冲液更换为连续Bjerrum系统。
• IEF-PAGE ：所有样本均在pH 2–6凝胶上进行分析，如前所述；使用不连续缓冲液系统进行单次印迹。
• EPO检测 ：印迹后，用5%脱脂奶封闭膜，并在4°C下与生物素化的AE7A5抗EPO抗体(0.5 μg/mL)孵育过夜。与链霉亲和素-HRP在室温下孵育45分钟后，使用Immobilon ECL Ultra Western HRP底物进行化学发光检测和信号放大。图像用CCD相机记录。
3 结果与讨论
使用法国反兴奋剂实验室认可的兴奋剂控制样本中EPO检测方法对血浆和尿液进行分析。考虑了世界反兴奋剂机构技术文件TD2024EPO中的标准进行解释和结论。将IEF-PAGE、SDS-PAGE和SAR-PAGE获得的EPO谱图与一名健康受试者(野生型，WT)和一名Eprex给药受试者的谱图进行比较。
3.1 IEF-PAGE分析
所有患者的血浆EPO谱图均显示碱性谱图，在内源性区域(定义为低于rEPO BRP标准的亚型)几乎没有信号，且最强烈的亚型出现在高pH范围内(碱性区域的第3-5位)。该谱图甚至比rEPO BRP标准更碱性，后者最强烈的条带位于第1-3位。患者特定的碱性谱图随时间保持稳定，在数年内保持不变。它明显不同于WT血液EPO谱图，也不同于给予rEPO Eprex后观察到的谱图。
然而，考虑到TD2024EPO中的标准，所有患者样本都将被视为可疑的rEPO，并将使用SDS/SAR-PAGE进行确认分析。
患者的尿液EPO谱图比其血液谱图稍偏酸性，正如先前在WT EPO的血液和尿液之间观察到的那样。这种差异被归因于肾脏过滤过程。有趣的是，与WT EPO相比，患者的EPO从血液到尿液沿pH梯度下移的比例(大约一到两个亚型位置)是相似的。由于这种偏移，患者尿液中强度最高的亚型是第2-4位，并且处于碱性区域，这更接近rEPO标准品(如BRP或Eprex)的亚型分布(第1-3位)。在兴奋剂控制背景下，这种谱图将高度怀疑使用了rEPO，尤其是在考虑自2007年以来上市的EPO生物类似物(它们可能呈现与原始rEPO药物不同的碱性谱图和亚型分布)的情况下。无论如何，这将触发额外的SDS-PAGE或SAR-PAGE分析。
3.2 SDS/SAR-PAGE分析
通过SDS-PAGE或SAR-PAGE，患者和健康受试者的EPO谱图非常相似。在凝胶的内源性区域(定义为使用Dynepo作为标记的参考线以下)出现单一的EPO条带。相反，Eprex给药后的EPO谱图呈现出典型的条带上方弥散，反映了rEPO的存在。尿液和血浆谱图之间的条带位置没有差异。然而，与WT受试者以及对多名运动员样本的观察结果(数据未显示)相反，患者血浆的EPO信号强度(从1到1.2 mL免疫纯化)远高于从15 mL尿液制备后的EPO信号强度。尿液在收集后被冷藏或冷冻保存，并在分析前保持冷冻以限制降解。因此，WT和患者之间、以及尿液和血液之间EPO信号强度的明显差异，可能反映了患者尿液中通过的EPO量较低。这可能是由于肾脏过滤/重吸收机制优先保留了碱性亚型。
患者的SDS/SAR-PAGE分析将不符合TD2024EPO中的标准来判定存在rEPO。因此，即使一名运动员呈现出与这些患者相似的情况(尽管可能性极低)，也不会导致不良分析结果。
3.3 根据反兴奋剂标准演变对谱图的解释
考虑到本文呈现的结果，在2013年之前以及世界反兴奋剂机构TD2013EPO强制将SDS/SAR-PAGE方法用于rEPO确认之前，需要评估错误宣布rEPO存在(假阳性)的风险。然而，患者的IEF谱图不同于使用原始rEPO药物后观察到的谱图。2013年之前世界反兴奋剂机构技术文件(TD2004EPO, TD2007EPO, TD2009EPO)中主要的rEPO鉴定标准之一是：“通过光密度测量的两个最强烈条带应位于碱性区域，应是连续的，并且应是条带‘1’和‘2’或‘2’和‘3’”。对于患者血液EPO IEF谱图，两个最强烈条带(条带4和5)的定量分布不符合此鉴定标准。对于患者的尿液也是如此，两个最强烈的条带位于第3位和第4位。自强制规定对任何运动员样本中的rEPO怀疑进行SDS/SAR-PAGE确认以来，就不可能再出现假阳性案例。
如果仍有任何疑问，高水平运动员携带相同突变的可能性极低。这些因EPO 基因座非编码区突变而患有红细胞增多症的患者需要定期医疗随访和放血治疗，这似乎与高水平运动的实践极不相容。再加上剧烈运动导致的脱水，血液黏度可能导致血管并发症、头痛、头晕和视觉障碍。因此，一名运动员因类似突变而被错误地暂停参赛，归咎于滥用rEPO，似乎极不可能。
4 结论
在家族性红细胞增多症患者中发现的EPO 基因座非编码区突变可能影响调控元件，并间接改变释放到循环中的成熟EPO蛋白。EPO糖基化的差异是特定碱性IEF谱图的主要解释，并且可能参与了这些患者的高促红细胞生成活性。导致这种EPO产生的机制仍在研究中，但可能与肾脏以外的EPO 表达有关，最有可能是在肝脏。反兴奋剂背景下使用的EPO检测IEF-PAGE方法，现在可被视为一项有价值的技术，用于识别和更好地理解某些特发性红细胞增多症的原因，以及可能与EPO质量变化相关的额外肾脏或肝脏病理。在反兴奋剂背景下，发现具有可疑但自然的碱性IEF EPO谱图的运动员的风险似乎极低，并且根据现行有效的世界反兴奋剂机构技术文件，不会导致宣布不良分析结果。在任何发现意外EPO谱图的情况下，都强烈建议评估血液和尿液中的谱图，以及评估不同时间点收集的样本中的EPO谱图。特征性谱图的一致性将倾向于支持运动员的生理特性，而不是反对使用了外源性的违禁药物。
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