引言
萨比亚病毒（SABV），亦被称为巴西哺乳类沙粒病毒，是一种包膜、单股负链、双节段的RNA病毒，属于沙粒病毒科，并被归类于新世界沙粒病毒复合体的B进化支。这一进化支包含了其他能引起严重出血热的致病性威胁病毒，如查帕雷病毒（CHHF）、马秋波病毒（MACV）、胡宁病毒（JUNV）和瓜纳里托病毒（GTOV）。SABV于1990年在巴西圣保罗州的科蒂亚市首次被发现。在过去40年中，全球仅确认了4例自然获得性感染病例，全部死亡且均与农村环境有关。对SABV的演化、致病性和自然宿主（推测为野生啮齿类动物）的理解仍然有限，部分原因是缺乏特异的诊断工具，且该病毒的研究需要在生物安全四级（BSL-4）设施中进行，这在南美洲尚不可用。本研究旨在调查2019年12月至2020年1月期间在巴西圣保罗一家三级医院收治的两例最初被怀疑为严重黄热病（YF）、最终确诊为SABV感染的病例。
结果
病例发现与基因组测序
研究者采用无靶向宏基因组测序方法（SMART-9N）对八例黄热病病毒（YFV）RNA检测阴性的出血热患者样本进行分析。结果在样本SP17（一名有森林徒步史的52岁男性）中确认了SABV的存在。该患者于2019年12月30日就医，2020年1月11日死亡。通过对其余七例回顾性病例进行测序，研究者发现了另一例先前未检出的SABV感染病例SP19（一名来自阿西斯的63岁男性农村工人），该患者于2019年12月10日入院，12月12日死亡。对SP17和SP19样本进行重新测序以验证结果并排除污染可能。SP17和SP19样本分别产生了14,423,445和6,424,328条读数，其中分别有0.12%和0.002%的读数与SABV参考基因组比对成功。SP17样本的基因组覆盖率（S节段100%，L节段80.1%）高于SP19（S节段57.7%，L节段14.2%），这可能与SP19样本病毒载量较低以及症状出现至样本采集间隔时间较长有关。
遗传变异与诊断挑战
对SP17和SP19获得的SABV基因组进行分析显示，在核苷酸水平上，两个毒株之间S节段的同源性为73.06%，L节段为84.53%。与1990年的参考毒株SPH114202相比，SP17在S和L节段的核苷酸同源性分别为89.00%和73.59%。在核蛋白（NP）水平的氨基酸同源性方面，SP17、SP19与参考株之间为93-98.2%，而SP17与SP19之间为98.19%。这种显著的遗传多样性导致了现有基于1990年参考株设计的分子诊断方法（如Bowen等人的方案）无法有效检测出这些当代毒株。例如，在SP17基因组中，研究者发现其与参考株在特定引物（1696R）结合位点存在多达5个核苷酸错配。针对这一情况，研究团队基于SPH114202和新生成的基因组设计了六套新的PCR引物，并成功开发了针对低病毒载量样本（如SP19）的巢式PCR检测方法，有效提高了检测灵敏度。
系统发生与演化历史
最大似然法和贝叶斯系统发生分析均将SP17、SP19和SPH114202毒株明确归入新世界沙粒病毒的B进化支内，并形成了高支持度的独立分支。分析未发现种间重配或显著的全基因组重组证据。基于时间尺度校准的系统发生学分析估算出SABV最近的共同祖先出现在约414年前（L节段，95% HPD：142–750年）和1081年前（S节段，95% HPD：326–2,539年）。最保守的不确定性下限（142年）表明，SABV在巴西的隐匿传播至少已超过一个世纪。研究还估计SABV与查帕雷病毒共享一个共同的祖先节点，其分化时间可追溯至约1.5万年前（L节段）。新世界沙粒病毒与旧世界沙粒病毒的起源时间则更为久远，分别约为377万年前（L节段）和195万年前（S节段）。这些发现有力地证明了SABV并非近期才出现的病毒，而是已经在巴西生态系统中长期存在。
受体结合位点与糖蛋白分析
SABV的包膜糖蛋白前体（GPC）在翻译后裂解为稳定的信号肽（SSP）、附着糖蛋白GP1和融合糖蛋白GP2。分析显示，新毒株（SP17, SP19）的GP复合物与参考株SPH114202的氨基酸序列同源性为94%，其中GP2比GP1更为保守。为了探究新毒株在GP1上与人转铁蛋白受体（hTfR1）结合位点（RBS）的氨基酸变异及其对受体趋向性的潜在影响，研究者利用AlphaFold3生成了SABV GP1（基于SP17毒株）的同源模型。结构映射分析发现，与参考株相比，SP17毒株GP1中仅有N208D和R216T两个位点发生了氨基酸替换，且这两个位点均位于预测的TfR1结合区域的边缘。分析认为，N208D可能导致界面静电特性发生微小变化，而R216T（侧链变小）不太可能引入空间位阻，因此这两个替换不太可能对TfR1结合产生有害影响。这一结果支持了SABV毒株间可能存在着维持TfR1识别的选择压力的假说。此外，新毒株中一个潜在的N-连接糖基化位点（N88S）的缺失，可能与抗原压力下的进化有关，类似于其他沙粒病毒中观察到的现象。
讨论
基因组监测技术揭示了在巴西圣保罗州发生的两例近期致命性沙粒病毒感染。本研究证实，从SP17和SP19患者样本中测序获得的病毒属于萨比亚病毒物种。流行病学调查表明，迄今为止所有已报告的自然获得性感染病例均有农村地区暴露史，且均为致命性后果，诊断多在死后才得以确认。对29名SP17患者的密切接触者进行筛查，未发现人传人病例，这表明两例SABV病例很可能是由未采样的啮齿类动物宿主分别独立引入人类种群的结果。由于土地利用变化增加了宿主与人类的接触，沙粒病毒的地方性流行区域预计将会扩大，因此有必要加强对潜在宿主啮齿动物的监测。值得注意的是，迄今为止检测到的四例自然发生的SABV病例中，有三例在圣保罗州的黄热病传播季节出现症状，而该地区近一半归因于出血热和神经侵袭性疾病的死亡病例仍未得到明确诊断。
对新型SABV序列的分析揭示了该病毒毒株在NP基因上存在显著的遗传多样性（核苷酸距离≥10%）。研究还为早期将SP17毒株描述为“SABV-like mammarenavirus”的报告提供了新的视角，通过更全面的系统发生和受体结合位点分析，明确了其SABV的物种分类。分子建模表明，当代SABV毒株在受体结合位点具有高度的序列保守性，与参考株共享TfR1介导的宿主细胞进入途径，意味着其物种趋向性和人畜共患潜力特征可能得以维持。
系统发生学分析表明，新世界沙粒病毒已经传播了数百万年，而SABV本身也已存在了数个世纪。本研究显示，现有的分子检测方法无法检测到当代SABV感染。鉴于目前的数据，SABV感染很可能长期未被发现，并在巴西圣保罗州隐匿传播。
巴西已发现了四种新世界沙粒病毒物种，包括库皮西病毒、阿马帕里病毒、弗莱沙勒病毒和萨比亚病毒。当前针对SABV的分子诊断方法存在的潜在局限性，凸显了利用无靶向宏基因组分析支持疫情调查、并增进对新世界沙粒病毒流行病学、演化和传播动力学理解的重要性。尽管已报告的SABV和其他B支新世界沙粒病毒感染在检出病例中具有高病死率，但这一估计很可能因监测和诊断偏向于重症和致死性病例而被高估。很有可能存在未被发现的轻度或亚临床SABV感染，正如两例实验室相关感染病例均存活所表明的那样。尽管利巴韦林已在拉沙热中显示出益处，并被经验性地用于其他沙粒病毒感染，但其对萨比亚病毒感染的有效性证据尚缺，临床结局可能反映的是疾病严重程度的谱系而非抗病毒效果。针对SABV的实验性治疗方案（如利巴韦林）与快速即时诊断方法的开发相结合，对于患者管理可能至关重要。
材料与方法
本研究获得了巴西国家研究伦理委员会的批准。患者样本来自圣保罗大学医学院附属的主要三级医院Hospital das Clínicas，该院在2018-2019年巴西黄热病疫情期间收治了重症病例。研究者从8例YFV阴性患者的血清样本中提取病毒RNA，在生物安全三级（BSL-3）实验室使用SMART-9N协议进行无靶向宏基因组测序，并在牛津纳米孔技术公司的MinION平台上进行测序。通过Kraken2进行分类，并使用minimap2将读数比对到SABV参考基因组以进行基因组组装和变异分析。获得的基因组序列已提交至GenBank或公开在GitHub仓库。
系统发生分析使用了来自国际病毒分类委员会（ICTV）的参考数据集，涵盖了新世界沙粒病毒（NWA）和旧世界沙粒病毒（OWA）复合体的A、B、C进化支的病毒物种。使用PhyML和IQ-TREE软件分别构建了最大似然系统发生树。为了推断SABV的进化历史，使用BEAST软件并应用时间依赖性速率模型，基于已发表的拉沙病毒进化速率设置了先验分布，估算了SABV最近的共同祖先时间。使用RDP4软件对所有可用的方法进行了潜在重组事件调查。
对于GP1的结构分析，将SABV GP1（SP17毒株）的氨基酸序列提交至AlphaFold 3服务器生成同源模型，并使用PyMol进行结构映射分析。潜在的N-连接糖基化位点使用NetNGlyc进行预测。
为了开发新的检测方法，研究团队基于1990年的SABV参考基因组及本研究新获得的序列，设计了六对新的RT-PCR引物。选择NP基因内的保守区域以确保检测的灵敏度和特异性，并在序列变异区域引入简并碱基以提高与流行毒株的兼容性。通过使用SP17和SP19患者样本的cDNA对引物性能进行验证。此外，还设计了两套巢式cPCR引物组以尝试检测低病毒血症病例。经过临床样本验证后，选定的引物组被用于筛查29名高危医护人员接触者。详细的实验室方案已公开在protocols.io平台上。
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