酶-底物-抑制剂复合物的形成会影响时间依赖性的抑制动力学

时间：2026年2月21日

来源：Drug Metabolism and Disposition

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在预测药物-药物相互作用（DDIs）时，评估细胞色素P450（CYPs）酶的时依赖性抑制（TDI）动力学至关重要。本研究通过数值分析方法对13个体外TDI数据集进行建模，发现酶-底物-抑制剂（ESI）复合物的形成会导致抑制常数（K_I）和失活速率常数（k_inact）的估计值差异达2.94倍，显著影响DDI预测强度（从轻度到强效）。结果证实，体外TDI模型需纳入ESI等复杂动力学机制以提高体内DDI预测的可靠性。

Jaydeep Yadav|Jan Wahlstrom|Ken Korzekwa|Swati Nagar

美国新泽西州Rahway市默克公司（Merck & Co., Inc.）药物动力学、代谢学与生物分析部门

摘要

为了预测药物相互作用（DDIs），筛选和评估细胞色素P450（CYPs）的时间依赖性抑制（TDI）是药物发现过程中的一个重要环节。通过体外实验获得TDI参数（抑制剂结合常数K_I和失活速率常数k_inact），这些参数随后用于预测临床DDI。本研究利用数值方法分析体外TDI数据集以估算K_I和k_inact。具体而言，研究了酶-底物-抑制剂（ESI）复合物的形成对K_I和k_inact估算的影响。共评估了13个数据集，所有数据集均表现出非Michaelis-Menten动力学特征，包括活化、双相失活、部分失活和多重结合动力学。分别对有无ESI形成的情况进行了模型构建。结果显示，不同模型之间的失活效率差异在0.67倍到2.94倍之间，这导致对同一化合物的DDI预测结果从中等强度到强强度不等。这些结果表明，体外TDI模型应结合观察到的体外动力学复杂性，以提高体内DDI预测的准确性。

引言

药物代谢酶细胞色素P450超家族的不同成员在其酶生物化学和动力学特性方面已得到广泛研究。1, 2, 3 CYP催化的反应通常表现出非典型的酶动力学特征，活性位点的多重结合现象也已被建模。例如，萘普生通过CYP2C19的代谢和睾酮通过CYP3A的代谢显示出涉及多个底物与单一酶结合的非典型动力学过程。4, 5, 6 底物（S）与酶（E）之间的多重结合可以通过形成酶-底物-底物复合物（ESS）来建模。我们和其他研究者详细描述了由此产生的动力学行为，包括双曲线、双相、S形和底物抑制动力学。4, 7, 8, 9 类似地，抑制剂（I）的多重结合可以通过酶-抑制剂-抑制剂（EII）复合物来建模。在竞争性抑制实验中，可能形成EII或ESI（酶-底物-抑制剂）复合物。在这种情况下，由于多重结合事件，可能会观察到非典型的动力学行为。例如，在低[I]浓度下可能观察到活化现象，而在高[I]浓度下则观察到抑制现象。

CYPs的基于机制的失活（MBI）是时间依赖性抑制（TDI）的主要类型之一。缓慢的紧密结合和亲和标记剂也是TDI的其他类型。10 CYPs的MBI涉及CYP底物被CYP代谢成活性中间体，从而导致CYP在活性中间体离开活性位点之前被失活。11 TDI可能显著影响潜在的药物相互作用（DDIs），尤其是在联合用药的情况下。12, 13, 14, 15 已有报道了CYP TDI的详细机制，包括代谢物中间体复合物（MIC）的形成、部分失活、血红素破坏和蛋白修饰。我们之前研究了非典型多重结合动力学对CYP TDI动力学参数的影响。16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 结果表明，使用适当的动力学模型对观察到的体外动力学进行建模可以显著提高K_I（抑制剂结合常数）和k_inact（失活速率常数）的估算精度，从而提高体内DDI的预测准确性。

除了多种TDI机制外，体外实验中还观察到了由于多重底物/抑制剂结合引起的非典型动力学现象。标准的重绘方法无法捕捉到多重结合相互作用引起的动力学复杂性。我们已经证明，纳入EII复合物可以显著改善体外TDI动力学参数的估算。18, 19, 23 尽管在体内可能由于药物浓度低而观察不到多重结合现象，但任何关于体内药物相互作用的先验预测都严重依赖于体外动力学参数的准确估算。

在可逆抑制模式下，使用酶-底物-抑制剂（ESI）复合物来模拟完全非竞争性、完全混合型、部分竞争性、部分非竞争性和部分混合型可逆抑制。24, 25, 26 完全抑制和部分抑制分别指在最高测试浓度下达到100%和<100%的抑制。完全非竞争性和混合型抑制通过假设ESI复合物不产生产物来建模，而部分抑制（部分竞争性、部分非竞争性、部分混合型）则允许ESI复合物产生产物。虽然完全非竞争性抑制较为罕见，但CYPs的完全混合型和部分混合型抑制并不罕见。最近，使用X射线晶体结构发现了CYP105A1、双氯芬酸和兰考唑形成的ESI复合物的实验证据。27 在我们之前的工作中，尚未探索的一种TDI动力学机制是ESI复合物的形成。当抑制剂对酶的亲和力很高且底物浓度饱和时，预期会在体外孵育过程中形成ESI复合物。在标准TDI孵育中观察到，在酶最终失活之前，CYP活性在早期会增加。这种早期活化随后被失活的现象可以用酶-底物-抑制剂（ESI）复合物的形成来解释。此外，即使没有观察到活化现象，ESI的形成也是可能的，并且会影响失活动力学参数。在本研究中，我们探讨了包括ESI在内的多种酶动力学方案来模拟各种体外TDI数据集。本文展示了13种化合物的结果。本研究的目的是通过将ESI复合物纳入动力学方案来改进体外TDI动力学数据的拟合。

材料

用于LC-MS/MS的溶剂来自Honeywell（B&J AC/HPLC认证溶剂），为分析级。咪达唑仑（MDZ）、厄洛替尼和1’-羟基咪达唑仑（1’-OH MDZ）来自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）。来自Gibco的 pooled（N = 50个肝脏；28个雄性和22个雌性）人肝微粒体（HLM）。NADPH溶液A和溶液B以及¹³C₃ 1’-OH MDZ来自Corning Life Sciences（康宁，纽约州）。合成了一组专有的抑制剂

体外TDI孵育

使用标准的两步方法，利用 pooled HLM 测试了P450酶的TDI抑制。12 简而言之，将十二种抑制剂浓度（0 – 100 μM）与1 mg/ml的HLM悬浮液在0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中于37⁰C下孵育200 μl。在初步孵育混合物加热5分钟后，通过添加NADPH再生系统（最终浓度为1.3 mM NADP+、3.3 mM葡萄糖-6

结果

共建模了13个数据集，包括厄洛替尼和化合物1-12。选择这些化合物进行分析是因为分析体外TDI数据集需要在动力学方案中使用ESI。这些化合物具有多样的化学结构。表1列出了每种化合物的最佳拟合模型。为每个数据集开发并评估了多个动力学模型。

讨论

筛选具有TDI潜力的化合物是药物发现的关键步骤。此类研究可以识别出能够避免或管理临床DDIs的抑制剂。先前的研究表明，使用数值方法对体外TDI数据集进行建模可以提高临床DDI预测的准确性。18, 32 在本手稿中，我们探讨了体外测定中同时发生的底物和抑制剂结合（ESI复合物）对体外TDI参数（K_I和k_inact）的影响。