β-半乳糖苷酶在乳制品工业中对于生产低乳糖牛奶起着关键作用。然而，大多数市售的β-半乳糖苷酶是嗜温的，最佳反应温度范围为35至70°C（Gutierrez等人，2025年），因此无法承受高于70°C的高温杀菌过程（Arsalan等人，2020年；Lin等人，2018年）。因此，必须在牛奶冷却后添加这种酶进行反应。这一限制增加了工业生产过程中的微生物污染风险（Griep-Moyer等人，2022年）。另一种策略是使用适应低温的乳糖酶在低温下降解乳糖，但这需要分步骤进行巴氏杀菌和乳糖水解，导致工艺更加复杂。此外，许多商用β-半乳糖苷酶的最佳pH值偏酸（Shaikh等人，1999年；Zerva等人，2021年），与牛奶接近中性的pH值不兼容。因此，发现和研究具有中性最佳pH值的耐热β-半乳糖苷酶在乳制品工业中具有重大价值。
先前的研究已经指出，来自Pyrococcus furiosus的β-半乳糖苷酶BgaS是一个有前景的候选酶，因为它具有较高的热稳定性。例如，BgaS的最佳反应温度为90°C或更高，在80°C下孵育4小时后仍能保留超过80%的酶活性（Dong等人，2014年）。此外，其最佳pH值7.0与牛奶的pH值非常接近。然而，在以往的研究中，BgaS的异源表达主要在E. coli中进行（Dąabrowski等人，2000年；Dong等人，2014年）。由于E. coli具有产生毒素的能力，这引发了食品安全问题，在食品工业中是不可接受的（Movahedpour等人，2022年）。另外，由于Pyrococcus furiosus的BgaS是一种胞内酶，关于其分泌表达的报道很少，进一步限制了其工业应用潜力。
为了利用BgaS的优势特性并克服上述限制，选择一个具有强大蛋白质分泌能力的食品安全表达宿主至关重要。Bacillus subtilis是一种被广泛认可的GRAS（Generally Recognized as Safe）表达宿主（Yang等人，2016年）。该物种及其衍生物具有增强的蛋白质分泌能力（Gu等人，2018年；Xiang等人，2020年），并且拥有多种分泌途径和全面的信号肽系统，使其在蛋白质表达和分泌方面具有优势（Chen等人，2016年；Degering等人，2010年）。先前的研究表明，尤其是属于B. subtilis Sec途径的信号肽具有最高的分泌效率（Brockmeier等人，2006年；Duan & Luan，2023年）。例如，改良的高性能宿主菌株B. subtilis WB800表现出优异的分泌能力（S.-C. Wu等人，2002年）。然而，在构建过程中引入了三个外源抗生素抗性基因，这对工业应用存在安全风险。随着CRISPR基因编辑技术在B. subtilis中的应用，现在可以构建出无痕且食品安全的菌株用于工业用途（Y. Wu, Liu等人，2020年；Y. Wu, Chen等人，2020年）。
在这项工作中，选择了来自P. furiosus的β-半乳糖苷酶BgaS在B. subtilis中进行分泌表达。基于B. subtilis WB800，使用CRISPR-Cpf1基因编辑系统无痕敲除了外源抗性基因，构建了一种食品安全的B. subtilis表达宿主BS801。随后通过信号肽筛选研究了BgaS在BS801中的分泌表达，进一步降低了生产成本和潜在的安全风险。结果表明，这种食品安全菌株能够有效分泌BgaS，乳糖水解数据表明其在乳制品加工中具有很高的应用潜力。
