用于韩宇肌肉卫星细胞（Hanwoo muscle satellite cells）基于段落的质量控制的机器学习框架，应用于培养肉（cultured meat）的生产

基于肌原卫星细胞传代过程中增殖与衰老指标的机器学习多变量评估框架构建及其在培养牛肉质量控制中的应用

Sanghun Park|Sol-Hee Lee|Gyutae Park|Jungseok Choi

忠北国立大学动物科学系，韩国清州28644

摘要

来自韩牛（Hanwoo）的肌源性卫星细胞在培养肉和畜牧业生物技术中具有很高的价值，它们作为生物制造替代蛋白（特别是培养牛肉）的主要细胞底物，有助于开发标准化、高价值的培养牛肉产品。我们建立了一个多变量分级框架，该框架整合了增殖和衰老的指标，以客观评估细胞的质量。对于缺失的生物标志物数据（G0/G1期、早期凋亡、γH2AX、SA-β-半乳糖苷酶、端粒酶），我们使用活细胞数量进行插补，随机森林回归模型的表现更为优越（R² > 0.93）。主成分分析和K均值分析（k = 3）将细胞分为三个等级：早期（P2–P3）、中期（P4–P7）和晚期（P8–P12），这一分类结果也得到了偏最小二乘判别分析的验证。SA-β-半乳糖苷酶、活细胞数量和端粒酶是最有影响力的判别因子。RNA测序证实了细胞在传代过程中从增殖状态向衰老状态的转变。该框架有助于建立标准化的批次释放标准，并为培养牛肉生产中的批次限制提供科学依据，从而加强技术准备，并实现与监管要求一致的质量控制策略。尽管本研究使用的是来自单一供体的细胞，但未来需要通过多个供体的验证来评估该框架的稳健性和普适性。

引言

培养肉，也称为实验室培育肉或细胞基肉，是解决传统畜牧业生产中面临的可持续性、动物福利和食品安全问题的一种有前景的解决方案。这项技术的核心是使用动物来源的细胞，这些细胞必须在体外高效增殖并分化为肌肉组织（Bhat等人，2014；Bhat等人，2015）。在各种细胞类型中，原代肌肉卫星细胞因其固有的肌生成潜力和与体内肌肉再生过程的高度相似性而被认为是最具有生理相关性的来源（Datar & Betti，2010；Post，2012）。这些细胞特别适用于需要高保真度模拟肌肉组织的应用，例如高端培养肉产品（Jara等人，2023）。

然而，使用原代细胞在长期培养中存在挑战。与永生化细胞系不同，原代卫星细胞的增殖寿命有限，在连续传代过程中容易发生复制性衰老、凋亡和基因组不稳定（Stout等人，2023；Wang等人，2025）。这些变化会降低生产效率并影响产品的一致性。尽管已经探索了多种指标（如衰老和增殖能力）来评估细胞状态，但由于缺乏评估体外扩增过程中细胞质量的标准化系统，因此难以预测性能并确保批次间的稳定性（Pajčin等人，2022；Sinha等人，2024；Stange等人，2020）。

这凸显了需要一个能够整合多种细胞参数的稳健分类框架的必要性。基于形态学或单一衰老标志物的传统评估方法无法反映细胞衰老的复杂和动态特性，因为与衰老相关的变化涉及多个部分独立的生物途径，任何单一指标都无法完全捕捉到。因此，开发一个多变量和客观的分类系统对于准确评估和分级不同传代阶段的细胞质量至关重要（Todhunter等人，2024）。

从工业角度来看，使用原代细胞还需要稳定的供体动物供应。这一需求可能导致专门用于培养肉生产的优质供体动物饲养业的发展。在这方面，韩牛（韩国有本土牛品种）具有战略优势。韩牛是韩国国家管理的品种，其胴体质量通过政府认可的牛肉分级系统进行严格监管。该系统确保了可追溯性、一致性和质量保证，这些都是扩大培养肉生产规模的关键（Chung & Kim，2005；Edea等人，2015）。利用韩牛来源的细胞可以利用现有基础设施生产标准化、高品质的培养肉产品。正在进行的研究还在探索将韩牛肌肉细胞用于培养肉的可能性，进一步证明了其在工业应用中的价值（Choi等人，2025；G. Park等人，2024；S. Park等人，2022）。

此外，当从屠宰场处理的动物肌肉组织中分离出卫星细胞时，死后确定的胴体质量分级信息可以追溯地与相应的细胞批次关联起来。在这种情况下，死后收集的胴体质量分级数据不是用于前瞻性选择供体组织，而是可以追溯地与用于分离卫星细胞的肌肉样本匹配。这种方法允许进行回顾性分层，并将基于胴体的质量指标与细胞性能指标结合起来。这样的方法有助于保持生产批次间的一致性，并将传统肉类科学与细胞农业联系起来。因此，基于胴体的质量指标不应被视为卫星细胞质量的直接预测因子，而应视为可以与多变量细胞性能数据回顾性结合的供体级信息。

因此，本研究利用韩牛肌肉卫星细胞作为模型系统，开发了一个基于多变量和传代的分类框架，该框架整合了衰老和增殖标志物。通过基于机器学习的插补、监督聚类和判别分析，本研究旨在提供一种可扩展的、客观的细胞质量分级方法，适用于培养肉和畜牧业生物技术的背景。该框架支持培养牛肉生产中的标准化批次释放标准和批次限制，从而有助于食品安全、产品一致性和替代蛋白领域的监管准备。

与以往主要关注单一生物标志物或描述性细胞衰老评估的研究不同，本研究引入了一个基于多变量和机器学习的框架，用于原代肌肉卫星细胞的传代依赖性质量分级。据我们所知，这是首次将与衰老相关的标志物、增殖能力和转录组特征整合到一个专为体外扩增过程设计的客观分类系统中。通过将连续的生物变化转化为操作性分级方案，该框架实现了标准化的质量控制、批次限制定义和批次释放决策。利用韩牛肌肉卫星细胞作为模型系统，本研究将传统肉类科学与细胞农业结合起来，提供了一种可扩展且具有工业相关性的细胞质量管理方法。

部分内容摘录

韩牛原代肌肉卫星细胞的分离和荧光激活细胞分选（FACS）

从忠清北道清州市清原区FarmStory Hannaeng Central Factory收集了一头25个月大的韩牛（韩国有本土牛品种）屠宰后的上圆部分的骨骼肌组织。屠宰后，肌肉组织被放入冰盒中，并在大约20分钟内运输到实验室。所有后续的组织处理和酶解操作都在组织收集后1小时内开始。肌肉组织被切成小块

用于长期传代培养的韩牛肌肉卫星细胞的分离和FACS富集

在开始韩牛肌肉来源细胞的长期传代培养之前，供体组织的收集和原代细胞的分离在同一天内完成。分离出的细胞被接种并培养9天以达到第1代（P1）。随后进行荧光激活细胞分选（FACS）以富集特定亚群。根据操作定义，CD31和CD45阴性、CD29和CD56阳性的细胞被认为是富集了肌源性卫星细胞的亚群

结论

本研究开发了一个多变量系统，根据不同传代阶段对韩牛肌肉卫星细胞的质量进行分类。通过结合与细胞增殖和衰老相关的测量数据，并应用监督学习和无监督学习方法，我们发现细胞在培养过程中发生了明显的变化。本研究识别的细胞群代表了三个不同的细胞阶段：增殖阶段、中间阶段和

CRediT作者贡献声明

Sanghun Park：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、可视化、验证、研究、概念化。Sol-Hee Lee：撰写 – 审稿与编辑、验证。Gyutae Park：撰写 – 审稿与编辑、验证。Jungseok Choi：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资金获取、概念化。

伦理批准

该动物研究方案获得了忠北国立大学机构动物护理和使用委员会的批准。

资金支持

本工作得到了韩国食品、农业和林业技术规划与评估研究所（IPET）的支持，该研究所通过农业、食品和农村事务部（MAFRA）的高附加值食品技术开发项目提供资助（项目编号321028–5）。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Jungsook Choi报告称获得了农业、食品和农村事务部的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。