多材料三相支架通过模拟肌腱-骨止点微环境调控早期细胞响应
1 引言
在骨科手术领域，肌腱和韧带（T/L）损伤是最常见的软组织损伤之一。急性或慢性的T/L损伤对现代社会构成重大的临床挑战，给卫生系统带来沉重的经济负担，并严重影响患者的生活质量。目前针对此类损伤的治疗方法（如直接缝合、自体或异体移植）往往失败率较高，特别是无法重建肌腱/韧带与骨骼连接的复杂界面——即肌腱-骨止点。该结构并非一个简单的附着点，而是一个主动且动态的界面，可根据机械负荷进行适应性重塑。人体中存在纤维性和纤维软骨性两种止点，其中纤维软骨性止点更为普遍（如肩袖肌腱、前交叉韧带、跟腱的附着处），其组织结构包含纯致密纤维结缔组织（肌腱）、非钙化纤维软骨、钙化纤维软骨和骨骼等连续过渡区域。
鉴于当前手术方法在重建止点的结构和功能组织方面存在不足，开发能够模拟其空间异质性和生物力学特性的仿生组织工程策略显得尤为迫切。本研究在前人工作的基础上，重点表征了由Micalizzi等人设计开发的、用于模拟止点的三相支架的细胞响应。该支架通过将电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）的肌腱样区域与熔融沉积成型（FDM）打印的聚己内酯（PCL）骨样区域相结合，并在两材料重叠处形成模仿止点的过渡区域，旨在复制原生止点的梯度组织。本研究采用人骨髓间充质干细胞（hMSCs），特别是单细胞衍生的SCP-1细胞系，来探究细胞的粘附、迁移、增殖和组织，以及支架三个区域的物理化学和形态特性对细胞行为的影响。考虑到机械刺激在肌肉骨骼工程中的关键作用，研究还设计并使用了定制的生物反应器，以比较静态和动态（两种刺激方案）条件下细胞的形态和取向变化。本文通过整合生物学-生物力学评估，为利用周期性应变刺激与三相支架异质结构之间的协同作用，促进区域特异性早期细胞分化的可能性提供了新的见解。
2 结果与讨论
2.1 支架生物相容性验证
2.1.1 细胞粘附、迁移和细胞密度分析
支架的生物相容性通过细胞粘附、迁移、增殖和存活测试得到验证。研究结果显示，在静态条件下，当SCP-1GFP细胞仅被接种在骨样区域时，细胞在接种后4小时内开始附着，并在5天内增殖和迁移至整个支架，表明PCL纤维在促进细胞在支架结构内定植方面起着关键作用。相比之下，当细胞仅被接种在肌腱样区域时，它们主要被限制在该区域内，细胞数量在培养期间保持相对稳定，这可能是因为细胞被困在了PLGA纳米纤维网络中。这种行为的差异可能与支架的制造方法有关，PCL网格顶部与PLGA垫上表面之间的高度差（约200µm）可能阻碍了从肌腱样区域向骨样区域的迁移。
2.1.2 扫描电子显微镜
扫描电子显微镜图像显示，在培养5天后，虽然无细胞非织造结构保持完整，但PLGA纤维在接触点出现融合和膨胀，这种融合现象赋予了支架一个重要的特征：纳米纤维的波浪形图案类似于人体肌腱胶原纤维的自然曲率。SEM图像进一步展示了细胞在骨样和肌腱样区域的附着和铺展方式。在纤维软骨区域的图像中，观察到细胞利用PCL纤维作为桥梁迁移并成功定植整个支架。
2.1.3 延时分析
延时分析显示，在PLGA区域，细胞在观察的培养日内大多保持在相同位置，这可能归因于它们能够粘附并牢固地包裹纳米纤维，并在第3天开始形成细胞单层。而在骨样区域，细胞表现出更活跃的随机运动行为。
2.2 细胞活力，静态测试
通过Resazurin/AlamarBlue ELISA测定评估细胞代谢活性和增殖。在培养的前5天，细胞代谢活性/增殖增加，随后趋于平稳，表明支架上的细胞已达到融合。在第5天，细胞数量是第1天的3倍左右。活/死测定结果显示，死亡细胞在纤维软骨样和肌腱样区域浓度较高，而在骨样区域未检测到。这表明支架具有较高的生物相容性。
2.3 细胞活力，动态测试
研究的第二部分聚焦于探究周期性应变刺激对接种在三相止点样支架上的SCP-1细胞的影响。研究采用了两种不同的刺激方案：动态方案1和动态方案2。结果显示，三种条件下（静态、DP1、DP2），细胞代谢活性在5天培养期内均有所增加，表明生物反应器环境和施加的周期性应变并未干扰细胞代谢/增殖活性，也没有对细胞性能产生负面影响。活/死测定结果与静态分析一致。
2.4 细胞形态与取向
为了探究支架的形态和物理化学特性，结合施加的周期性刺激，是否影响细胞形态和取向，研究评估了细胞的纵横比和取向。
在骨样区域，从第1天到第5天，细胞的纵横比值在0.78至0.55之间，两种动态刺激方案没有显示出明显的效果。所有方案都导致了纵横比的降低，但对于两种动态方案，这种效应在刺激3天后不再显著。
在肌腱样区域，细胞从一开始就表现出较低的纵横比值，培养5天后纵横比范围降至0.58–0.25，表明这些细胞形态向纺锤形转变。不同的刺激方案间存在显著差异，表明刺激方式具有影响。时间点之间也存在显著差异，说明时间因素也施加了额外影响。动态方案1在降低纵横比中值方面表现出更显著的能力，表明这种条件可能更有效地促进细胞伸长。这种效应可能与肌腱样区域的形态特性以及施加的周期性动态刺激都有关系。在静态条件下，细胞伸长主要与PLGA纤维的平行排列有关。然而，排列整齐的纤维与动态方案1的结合放大了细胞伸长，而动态方案2的效果则不明显。
细胞形态和取向研究表明，支架骨样区域的细胞保持卵圆形，而肌腱样区域的细胞则表现出非常细长的纺锤形。自动“分析颗粒工具”提供了细胞取向数据。在动态方案1组中，到第5天，大多数细胞的取向与支架的x轴（即PLGA纤维排列方向）约成10°角。总体而言，随着时间的推移，每个组中的细胞都变得更倾向于平行于支架的长边排列。
2.5 初步基因表达分析
为了解在无分化培养基刺激的情况下，支架表面和/或负荷是否会驱动SCP-1细胞谱系特异性标志物的上调，研究通过定量反转录聚合酶链式反应对成骨、成软骨和成肌腱谱系的基因进行了初步筛选。
骨相关的转录因子Runt相关转录因子2在所有支架区域均有表达。骨涎蛋白在动态加载下的骨区域表达上调，而在其他支架区域仅中度表达。软骨相关的转录因子在动态负载下的支架骨区域上调，而蛋白聚糖在动态负载下的纤维软骨区域表达上调。
有趣的是，即使没有生化刺激，某些因子也会上调。例如，骨涎蛋白信使核糖核酸水平在负载下的骨区域增加，而在纤维软骨和肌腱区域仅表现出低表达。肌腱相关的转录因子早期生长反应蛋白1在所有区域表达，而早期生长反应蛋白2仅在纤维软骨和肌腱区域表达。另一个转录因子肌腱因子在骨和肌腱区域中度表达，与动态负载无关。I型胶原和III型胶原在所有支架区域高度表达，而血小板反应蛋白-2在静态和动态负载下的纤维软骨和肌腱区域表达更高。肌腱特异性成熟基因肌腱调节蛋白在支架的骨和肌腱区域表达，并在负载下的纤维软骨区域中度表达。
因此，即使在没有生化刺激的情况下，该支架也保留了SCP-1细胞的多向分化潜能，并诱导了一些负荷特异性的基因表达。有趣的是，单独的支架区域梯度并没有强加主要的基因表达限制，这表明与细胞分化相关分子因子的相互作用对于在空间上分层确定细胞谱系是必需的。
3 结论
总之，本研究证明了周期性应变刺激在调节定植于止点支架上细胞的生物反应方面的潜力。动态刺激方案1因其对细胞伸长和平行取向的影响而成为最有利的选择。初步的基因表达分析提供了初步证据，表明该区域化支架保留了SCP-1细胞的多向分化潜能，并且即使没有与分化相关的生化刺激，也出现了早期的、特异性的基因表达模式。虽然这些观察主要基于形态学指标和初步的转录数据，但它们表明材料特性和力学线索在引导组织生长和再生中可以发挥重要作用。总体而言，本研究为改进的止点组织工程应用迈出了有希望的一步，并为未来包括空间分辨的蛋白质水平表征在内的研究奠定了基础，旨在更全面和更生理相关的条件下验证这些效果，最终支持其向治疗策略的转化。
4 实验部分
4.1 止点支架的制备
支架的制造方法如前所述。简言之，支架由三个不同的区域组成：由电纺PLGA构成的肌腱样部分、使用FDM技术3D打印的PCL骨样区域，以及这两个区域无缝集成的关键界面。通过定制的生物制造方案实现跨越止点的物理性质梯度。在该过程中，PCL（数均分子量80，000）被直接3D打印到电纺PLGA垫上。使用3D打印机挤出两层相互垂直的PCL层（每层厚0.2mm），在PLGA条带上形成网格结构。PLGA纳米纤维是通过将10%（w/v）的PLGA溶解在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，然后采用旋转滚筒收集器（直径100mm）进行电纺以获得排列整齐的纤维。
4.2 支架接种
支架被放置在定制的由生物相容性硅胶制成的支架座内，该支架座可适配6孔板，并能容纳多达800µL的培养基。随后，将支架浸入培养基中，并在37°C下孵育过夜，为细胞接种做准备。此孵育步骤会引起PLGA区域的水解，导致聚合物链断裂，从而使支架收缩，这在将支架夹入生物反应器进行动态培养前已被考虑，以尽量减少任何不需要的预应力。
4.3 支架生物相容性
4.3.1 细胞粘附、迁移和细胞密度分析
为了检查接种细胞对止点支架的定植情况，并了解其不同区域在不同培养时间点如何影响细胞行为，进行了两项平行测试。在第一项测试中，细胞仅接种在骨样区域；在第二项测试中，它们仅接种在肌腱样区域。在两种条件下，实验开始时均接种1×104个SCP-1GFP细胞。使用荧光显微镜在4小时、1天、3天和5天后观察。在每个时间点，对每个支架的每个区域内的三个不同区域进行成像。还通过分析培养30天后的支架，研究了接种细胞的长期行为。
4.3.2 扫描电子显微镜
使用扫描电镜在超微结构水平描述SCP-1GFP细胞的行为。准备了三个支架：干燥支架、无细胞孵育的湿润支架以及在整个表面接种了3×104个细胞的支架。样品在5天孵育期后进行观察。带有细胞的样品经过清洗、固定、脱水和干燥处理。
4.3.3 延时分析
进行延时分析以追踪SCP-1GFP细胞在支架上的运动。实验使用两台独立的支架，每台支架在整个表面区域接种总计3×104个细胞。第一个支架用于研究骨样区域，第二个支架专门用于探索肌腱样区域。支架放置在生物腔内，环境参数调节为温度37°C、湿度85%和CO2水平5%。测试通过在3天内以30分钟为间隔获取图像进行，捕捉骨样和肌腱样区域的单个区域。
4.4 活力测定，静态测试
为了获得关于细胞代谢活性和增殖的定量数据，进行了活力测定。使用了不表达GFP蛋白的SCP-1细胞。使用Resazurin/AlamarBlue测定法在5个不同的时间点评估代谢活性/增殖。使用微孔板荧光读数器测量荧光值。
4.5 使用定制生物反应器进行机械刺激
4.5.1 生物反应器设计
本研究通过定制设计的生物反应器来满足促进细胞增殖和活力所需的适当机械刺激需求。该装置根据止点支架的形态和力学特性量身定制，能够为实验目的提供精确有效的机械刺激。设计规范包括实施带有测力传感器以监测所施加应力的驱动单元、最小化设备在培养箱内的占地面积、允许用盖子密封腔室以隔离内外环境使其适合在非无菌条件的培养箱中使用，以及提供可选择的两组件系统。
4.5.2 周期性应变刺激
为了研究和评估所施加周期性应变的影响，使用两种不同的刺激方案进行了实验：动态方案1和动态方案2。刺激参数的选择基于文献证据。选择1Hz的频率是因为它能密切模拟与自然人体运动模式相关的生理范围。另一方面，文献中报道的应变幅度差异很大，从低至1%到高达10%不等。当在同一项研究中直接比较不同应变水平时，较高的幅度通常与肌腱/韧带相关标志物表达增加相关。然而，适度的应变值（如2.5%）已被证明能更好地长期保持支架的完整性和结构稳定性。因此，本研究采用了2.5%的应变（相对于支架肌腱样区域的长度计算），以确保可靠的机械负载而不会引起材料损伤。此外，刺激持续时间的调节也被报道为影响细胞增殖、基因表达和谱系特异性分化的一个重要变量。基于此，选择了两种每日加载时长不同的刺激方案，以系统评估受控机械环境下的细胞反应。
这些方案的刺激参数如下：动态方案1，刺激频率1Hz，应变2.5%（沿肌腱样区域长度测量），每天刺激30分钟；动态方案2，刺激频率1Hz，应变2.5%（沿肌腱样区域长度测量），每天刺激两次，每次30分钟，两次刺激之间间隔1小时。
4.5.3 用于生物反应器培养的细胞接种方案
为了将细胞接种到生物反应器内的支架上，支架被生物反应器夹具系统夹住。在此初步阶段，肌腱区域的长度比需要的稍长，以允许收缩过程并保持能被机械拉伸的正确长度。随后，在生物反应器腔室中加入12mL培养基，并将支架孵育过夜。过夜孵育后，移除培养基，然后在无菌环境下对支架进行风干。一旦支架完全干燥，将含有7.5×104个细胞的200µL培养基液滴滴在整个支架上。在接下来的2小时内，为防止培养基干燥并可能损害细胞活力，每20分钟添加50µL新鲜培养基。接着，用培养基完全覆盖支架，并将支架与生物反应器一起放入培养箱中以促进细胞生长并进行后续测试。
4.5.4 细胞活力，动态测试
使用两种刺激方案进行细胞活力测试。对于每种条件，使用3个独立的支架和不带GFP的SCP-1细胞进行测试。由于设计用于刺激的支架比静态条件下的支架稍大，为了保证静态和动态条件下相当的细胞密度，在每个支架上接种总计7.5×104个细胞。细胞代谢/增殖活性的测量遵循静态测试部分的方案。为了尽量减少试剂使用，将受刺激的支架暂时从生物反应器腔室中取出，放入硅胶支架中，并孵育4小时。在第1、3和5天评估活力。
4.5.5 活/死测定
在静态和动态条件下，对支架进行活/死测定。每组使用3个独立的支架，在培养1、3和5天后进行。在静态条件下，每个支架接种3×104个SCP-1细胞；而对于用于生物反应器中周期性机械拉伸的支架，则接种7.5×104个细胞。所有支架的接种过程均在硅胶支架座内进行，然后将其放入生物反应器培养腔室（用于刺激组）。使用活/死细胞成像试剂盒进行染色。
4.6 细胞形态与取向
为了研究止点支架的形态和物理化学特性，结合施加的周期性刺激，是否影响细胞形态和取向，使用活/死染色后获取的图像来分析SCP-1细胞的特性。该分析分为两个独立且平行的研究：检查骨样区域内的细胞形态；评估肌腱样区域内的细胞形态和取向。由于骨样区域的细胞取向主要取决于垂直的网格排列，因此未对其进行研究。
使用ImageJ软件及其自动分析工具来评估形态和取向。首先将荧光图像导入ImageJ软件并转换为8位单色图像；然后应用“高斯滤波”来增强细胞边缘检测并减少噪声；接着采用“自动阈值”和“IsoData算法”来区分单个细胞；最后使用“分析颗粒工具”自动提取细胞形态和取向。为了评估细胞形态，使用公式纵横比=宽度/长度计算纵横比。纵横比值接近1表示细胞形状更圆，接近0表示细胞形状非常细长。宽度和长度值使用“分析颗粒工具”从每张图像中的每个细胞自动获得。对于骨样区域的平均细胞纵横比计算，每个时间点研究1个支架，共评估50个细胞，分析3张图像。而对于肌腱样区域的平均细胞纵横比计算，每个时间点研究1个支架，通过分析三张图像共评估150个细胞。
4.7 通过定量反转录聚合酶链式反应进行初步基因表达筛选
从培养5天后的支架中提取RNA，培养条件为静态（对照）或动态负载。简而言之，将支架（1×105个细胞/支架）通过无菌手术刀切分为三个区域，用PBS洗涤，然后转移到含有RNA裂解缓冲液的Eppendorf管中。为了确保足够的RNA量，将每组支架之间相同的区域汇集，然后进行均质化、涡旋和离心。使用RNA提取试剂盒提取RNA。使用单细胞全转录组扩增试剂盒进行互补DNA合成。使用定制设计的96孔板进行定量反转录聚合酶链式反应。在本文中，分析主要集中在骨谱系的基因、软骨谱系的基因以及肌腱谱系的基因。甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参基因。
4.8 统计分析
使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行统计分析，随后在静态条件下使用邦弗朗尼校正的邓恩事后检验进行多重比较。为了比较不同时间点和方案之间的差异，进行双因素方差分析以评估两个因素之间的差异，然后进行事后比较。使用夏皮罗-威尔克检验和莱文检验分别评估数据的正态性和方差齐性。当违背正态性或方差齐性假设时，对秩变换后的数据进行统计分析。数据以平均值±标准差表示。p值小于0.05被认为具有统计学意义。显著性水平标示为p< 0.05，p< 0.01，p< 0.001，以及**p< 0.0001。
