1 引言
骨肉瘤（Osteosarcoma， OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤，标准治疗包括手术切除和全身化疗，但存在全身毒性大、药物分布不特异等问题。利用骨支架进行局部给药是一种有前景的替代方案，但面临药物滞留性差、不稳定以及机械强度不足等挑战。本研究旨在开发一种多功能植入体，将装载阿霉素（Doxorubicin， DOX）的脂质体整合到巴格达石（Baghdadite， Ca3ZrSi2O9， BAG）陶瓷中。BAG是一种锆增强硅酸盐陶瓷，已被证明具有优异的机械性能、生物相容性和骨再生能力。研究采用离子辅助等离子体聚合物（Ion-assisted plasma polymer， IPP）涂层来增强脂质体在陶瓷表面的固定并控制DOX的释放。
2 结果与讨论
2.1 未涂层与IPP涂层BAG陶瓷的表征
通过X射线光电子能谱（XPS）和扫描电子显微镜（SEM）分析证实了IPP涂层在BAG表面的成功应用。XPS分析显示，在IPP涂层的BAG样品中，BAG固有的钙（Ca）、锆（Zr）和硅（Si）元素特征峰消失，取而代之的是氧（O）、氮（N）和碳（C）的峰，这与IPP涂层的化学成分一致。SEM图像显示，IPP涂层完全覆盖了BAG的表面形貌，表明涂层均匀且保形。
2.2 Cy5标记脂质体及DOX在IPP涂层与未涂层BAG上的附着与释放
研究使用Cy5标记的脂质体来评估其在BAG表面的附着情况。共聚焦显微镜成像和ImageJ软件定量分析表明，在浸泡初始时刻和经过6周磷酸盐缓冲盐水（PBS）浸泡后，IPP涂层BAG的荧光强度（代表脂质体附着量）和脂质体表面覆盖率均显著高于未涂层BAG。通过十二烷基硫酸钠（SDS）高温洗涤实验进一步验证了共价附着的稳定性，结果显示，未涂层BAG表面的Cy5荧光信号下降了约63%，而IPP涂层BAG仅下降了32%，表明IPP涂层显著增强了脂质体附着的稳定性。
体外释放动力学研究表明，无论是Cy5标记的脂质体还是封装在内的DOX，从未涂层和IPP涂层BAG上的释放均呈现双相模式：初始几天内有一个突释，随后是缓慢、持续的释放。由于IPP涂层带来了更高的脂质体结合量，因此IPP涂层BAG释放的脂质体和DOX总量也更高。这种释放特性对于骨肉瘤局部治疗非常有利：初始突释可靶向术后残留的癌细胞，而后续的缓释则能提供长期的肿瘤抑制作用。
2.3 DOX负载脂质体BAG系统的抗肿瘤效应
2.3.1 细胞活力
研究通过直接接种（细胞与材料直接接触）和间接接种（细胞与材料共培养但不直接接触）两种方式，评估了BAG/DOXlipo系统对人骨肉瘤MG-63细胞和人成骨细胞（Human osteoblasts， HOBs）的影响。MTS细胞活力实验表明，在低DOX浓度（1.6 µg/mL）下，IPP涂层BAG/DOXlipo对MG-63细胞的毒性是未涂层BAG/DOXlipo的四倍，这归因于IPP涂层带来的更高脂质体结合量与药物释放量。共聚焦图像也证实，在直接接种条件下，IPP涂层BAG/DOXlipo表面的MG-63细胞增殖显著减少。
在间接共培养实验中，IPP涂层BAG/DOXlipo同样能显著降低MG-63细胞的活力，表明释放的DOX能有效扩散并对周围环境中的肿瘤细胞产生细胞毒性。至关重要的是，无论是直接还是间接接触，BAG/DOXlipo系统（无论是否含IPP涂层）对健康的HOBs均未表现出明显的细胞毒性，显示出其对肿瘤细胞的选择性杀伤潜力。
2.3.2 细胞成像
荧光显微镜观察进一步支持了细胞活力结果。在间接培养条件下，与IPP涂层BAG/DOXlipo共培养的MG-63细胞密度显著降低。相反，在相同条件下，HOBs在所有实验组（包括含DOX脂质体的组）中均显示出健康的细胞形态和均匀的分布，表明DOX负载脂质体对健康成骨细胞无不良影响。
2.3.3 流式细胞术
通过将绿色荧光蛋白（GFP）标记的MG-63细胞与HOBs共培养，并分析Cy5标记脂质体的摄取，发现虽然两种细胞在2小时内都摄取了脂质体，但MG-63细胞的荧光强度显著高于HOBs，表明骨肉瘤细胞对脂质体的内化能力更强。
在共培养体系中比较DOX负载脂质体与游离DOX的作用。流式细胞术分析显示，DOX负载脂质体能选择性地显著减少MG-63细胞的数量，而对HOBs影响较小。相反，游离DOX处理对两种细胞均表现出非选择性的强细胞毒性，导致MG-63和HOBs数量均大幅下降。定量分析细胞比例变化证实，DOX负载脂质体处理使共培养体系中HOBs的比例从50%上升至约75%，而游离DOX处理后的细胞比例几乎保持不变。这凸显了脂质体递送在靶向肿瘤细胞、保护健康细胞方面的优势，其机制可能与MG-63细胞更高的增殖速率和改变的磷脂酰胆碱代谢有关。
2.4 DOX负载脂质体BAG系统对HOBs骨传导性的影响
离子释放是生物陶瓷介导生物活性的关键机制之一。电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）分析显示，在21天的观察期内，未涂层BAG、IPP涂层BAG、IPP涂层BAG/空脂质体以及IPP涂层BAG/DOXlipo均能持续释放硅（Si）离子和钙（Ca）离子，且各组间无显著差异。这表明IPP涂层和脂质体附着并未干扰BAG固有的离子释放行为。
通过一个两阶段实验模型（先用MG-63细胞共培养模拟肿瘤抑制阶段，再接种HOBs模拟骨再生阶段）评估了材料的成骨潜能。茜素红染色显示，在IPP涂层BAG/DOXlipo组中观察到更多的钙沉积。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase， ALP）活性检测也表明，各组间ALP活性无显著差异。这些结果证实，DOX负载脂质体的存在并未损害BAG陶瓷的骨传导和骨诱导特性，确保了其在抑制肿瘤的同时支持骨再生的能力。
2.5 抗菌活性
通过活/死细菌染色和共聚焦激光扫描显微镜评估了材料对两种常见植入物相关病原体——金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， 革兰氏阳性）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa， 革兰氏阴性）的抗菌活性。培养6小时后，未涂层BAG、IPP涂层BAG和未涂层BAG/空脂质体对两种细菌的抗菌活性均很弱。而含有DOX的BAG/DOXlipo和IPP涂层BAG/DOXlipo样品则表现出强烈的抗菌作用，特别是对铜绿假单胞菌，致死率分别达到85%和89%；对金黄色葡萄球菌的致死率约为40%。机制研究表明，DOX负载脂质体处理能诱导细菌细胞内产生活性氧（Reactive oxygen species， ROS），氧化应激可能是其抗菌作用的重要机制。这一特性为植入物同时预防感染提供了额外保障。
2.6 研究局限性与未来方向
本研究使用块状BAG陶瓷作为概念验证，未来工作应扩展至三维打印的多孔BAG支架，并在合适的动物模型中进行测试，以更好地模拟临床相关的骨缺损修复场景。本研究的一个主要局限是缺乏体内验证，未来的动物实验需要在一个同时包含骨肉瘤环境和临界尺寸骨缺损的模型中进行，以直接评估该支架在肿瘤局部抑制和骨缺损再生方面的双重治疗效果。
3 结论
本研究成功开发了一种多功能骨支架，通过IPP涂层将DOX负载脂质体共价固定在BAG陶瓷表面。所构建的IPP涂层BAG/DOXlipo平台为骨肉瘤治疗提供了一个集肿瘤局部抑制、骨组织再生和感染预防于一体的综合性解决方案。IPP涂层增强了药物滞留和控释能力，实现了对骨肉瘤细胞的选择性杀伤，同时保留了健康成骨细胞的活力。该系统维持了BAG的生物活性离子释放和骨传导特性，并能有效对抗细菌感染。通过将这些功能整合于单一支架，该平台有望减少对全身化疗的依赖，提高局部治疗效果，最终改善骨肉瘤患者的临床预后和生活质量。
