引言
急性胰腺炎（AP）是常见的胃肠道疾病，也是导致急性腹痛相关住院的首要原因。在全球范围内，AP的发病率近年来呈上升趋势。虽然大多数患者表现为轻症、自限性疾病，但约有15%会进展为急性重症胰腺炎（SAP）。SAP是一种危重疾病，以严重的全身症状、高频的多器官功能障碍综合征（MODS）和高死亡率为特征。SAP的发病机制是多因素的，涉及一系列复杂的病理生理事件，这种复杂性阻碍了靶向治疗的发展。因此，目前的临床管理主要仍以支持治疗为主，迫切需要寻找有效的干预关键分子靶点。
铁死亡是一种铁依赖的、由磷脂过氧化驱动、并由谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗氧化系统衰竭所调节的细胞死亡形式。越来越多的证据表明，铁死亡在SAP的发病机制中扮演着关键角色。我们之前的研究也与此观点一致，证明了SAP模型小鼠中存在铁死亡的典型分子特征，包括GPX4水平耗竭和铁积累。这些发现凸显了抑制铁死亡作为SAP潜在治疗策略的前景。
与此同时，非编码RNA已成为炎症和细胞死亡通路的关键调节因子。其中，环状RNA（circRNA）是一类具有高稳定性和组织特异性的独特非编码RNA，它们作为竞争性内源RNA（ceRNA）与microRNA（miRNA）结合，调节靶基因的表达。值得注意的是，circDNMT3B（源自DNA甲基转移酶3B基因）已在多种疾病背景下被鉴定为miR-20b-5p的分子海绵。这些研究结果表明，circDNMT3B/miR-20b-5p轴是一个保守的调控模块，这促使我们研究其在SAP中的作用。
高车前素（Homoplantaginin， Homo）是一种从车前草等传统草药中提取的天然黄酮类化合物，具有显著的抗炎和抗氧化特性。鉴于其药理学特征，Homo成为治疗以剧烈炎症和氧化应激为特征的SAP的潜力候选药物。我们的生物信息学分析揭示了miR-20b-5p与铁死亡关键基因SLC7A11的3'非翻译区（3'UTR）之间可能存在直接的靶向关系。基于此发现，我们假设Homo通过circDNMT3B/miR-20b-5p/SLC7A11轴抑制铁死亡，从而减轻SAP。本研究旨在验证这一假说，为Homo作为SAP治疗药物提供新的证据和理论基础。
材料与方法
实验使用90只SPF级C57BL/6小鼠，随机分为9组，每组10只，包括正常对照组、SAP模型组以及涉及Homo治疗、circDNMT3B敲低和miR-20b-5p抑制的各种干预组。通过连续7次腹腔注射雨蛙素（50 µg/kg/次）并在最后一次注射时联合注射脂多糖（LPS，10 mg/kg）来诱导SAP模型。在建模24小时后，对指定组的小鼠连续3天静脉注射Homo（15 mg/kg）。
评估手段包括：胰腺组织的苏木精-伊红（H&E）染色进行组织病理学评估；血清分析（淀粉酶、细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18）；测量铁死亡标志物（丙二醛MDA、谷胱甘肽GSH、组织铁）；Western blot检测铁死亡相关蛋白（ACSL4、COX-2、SLC7A11、GPX4）的表达；qRT-PCR检测相关基因（circDNMT3B, miR-20b-5p, SLC7A11, GPX4）的表达水平。通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-20b-5p与SLC7A11之间的靶向关系。
结果
Homo减轻SAP小鼠的组织病理学损伤
与正常对照组相比，SAP模型小鼠的胰腺组织表现出严重损伤，包括水肿、炎性细胞浸润和腺泡坏死，总损伤评分显著升高。Homo治疗显著改善了这种损伤，使总评分降低了约64%，并且各项病理参数均得到显著改善。
Homo缓解SAP小鼠的系统性炎症、氧化应激和胰腺损伤
SAP诱导导致全面的病理生理紊乱。与正常组相比，SAP组血清淀粉酶活性显著增加，促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-18的水平也显著升高。同时，氧化应激失衡明显，表现为MDA水平升高和GSH水平降低。Homo治疗显著逆转了这些异常，降低了淀粉酶活性、细胞因子水平和MDA，同时恢复了GSH水平。结果表明Homo能有效减轻SAP诱导的胰腺损伤、系统性炎症和氧化应激。
Hono逆转SAP小鼠胰腺的铁死亡
Western blot结果显示，与正常组相比，SAP诱导显著抑制了铁死亡抑制蛋白SLC7A11和GPX4的表达，同时上调了铁死亡促进蛋白ACSL4和COX-2的表达。Homo治疗有效逆转了这些改变，恢复了SLC7A11和GPX4的表达，并抑制了ACSL4和COX-2的升高。此外，SAP小鼠胰腺组织中Fe2+ 含量显著升高，而Homo治疗显著降低了这种铁积累。这些发现表明，Homo通过协同调节关键的铁死亡通路蛋白来抑制SAP中的铁死亡。
Hono调控SAP小鼠中的circDNMT3B/miR-20b-5p/SLC7A11/GPX4轴
qRT-PCR结果显示，与正常组相比，SAP组miR-20b-5p表达显著上调，而SLC7A11和GPX4的mRNA水平显著下调。circDNMT3B表达有下降趋势但无统计学意义。Homo干预后，与SAP组相比，显著抑制了miR-20b-5p的表达，同时circDNMT3B、SLC7A11和GPX4的mRNA表达显著回升。这些mRNA水平的变化与蛋白检测结果一致，共同提示Homo可能通过上调circDNMT3B和抑制miR-20b-5p来激活SLC7A11/GPX4轴。
通过双荧光素酶报告基因实验证实，miR-20b-5p能直接靶向并结合SLC7A11的3'UTR，从而抑制其表达。
circDNMT3B的基因敲低削弱了Homo在SAP中的保护作用
通过腺病毒递送构建了circDNMT3B敲低的SAP模型。qPCR证实敲低成功。关键的是，在Homo治疗下，circDNMT3B的敲低导致miR-20b-5p的代偿性上调，并伴随铁死亡抑制因子SLC7A11和GPX4的mRNA水平下降。
组织病理学分析显示，circDNMT3B敲低显著减弱了Homo的保护作用。H&E染色显示，与对照相比，敲低组腺泡坏死和炎性浸润更为严重。这种保护作用的减弱在全身和分子水平上也得到验证：血清淀粉酶、炎症因子和MDA水平显著更高，而GSH水平更低；Western blot分析显示，在Homo治疗下，circDNMT3B敲低导致SLC7A11和GPX4蛋白表达下降，ACSL4和COX-2水平升高；胰腺Fe2+ 含量也显著更高。这些数据表明，circDNMT3B敲低有效逆转了Homo对SAP的治疗益处，功能上确立了circDNMT3B是Homo作用的关键上游介质。
miR-20b-5p通过逆转circDNMT3B敲低来抑制Homo的保护作用
为了确定circDNMT3B是否通过吸附miR-20b-5p发挥作用，我们在circDNMT3B敲低的SAP小鼠中同时给予了miR-20b-5p抑制剂。qPCR分析证实，抑制miR-20b-5p有效抵消了circDNMT3B敲低引起的分子改变，并恢复了其下游靶标SLC7A11和GPX4的mRNA水平。这种分子拯救转化为了组织病理学的改善：H&E染色显示，抑制miR-20b-5p显著改善了胰腺组织结构，减少了腺泡坏死和炎性浸润。此外，miR-20b-5p抑制还显著降低了血清淀粉酶、炎症因子和MDA水平，同时提高了GSH含量。胰腺Fe2+ 含量测定表明，抑制miR-20b-5p显著减少了异常的铁沉积。Western blot分析提供了结论性的蛋白水平验证：在circDNMT3B敲低条件下，抑制miR-20b-5p显著上调了SLC7A11和GPX4的蛋白表达，并下调了ACSL4和COX-2。
总之，特异性抑制miR-20b-5p完全挽救了circDNMT3B敲低诱导的有害表型。这在功能上确立了miR-20b-5p是circDNMT3B的关键下游效应因子，最终验证了核心调控轴：Homo → circDNMT3B → miR-20b-5p → SLC7A11/GPX4。
讨论
本研究确定了天然黄酮类化合物Homo作为治疗SAP的有效药物，并阐明了一个新的作用机制，即Homo通过新发现的circDNMT3B/miR-20b-5p/SLC7A11信号轴抑制铁死亡，从而减轻胰腺损伤。
本研究中建立的SAP小鼠模型不仅重现了预期的严重胰腺损伤和全身炎症，还呈现了明显的铁死亡特征，包括关键蛋白的失调和生化标志物的改变。重要的是，Homo干预有效逆转了这些铁死亡相关的异常，并显著减轻了组织病理学损伤，确定了抑制铁死亡是其对抗SAP保护作用的核心机制。
除了已知的抗炎和抗氧化活性外，本研究揭示了一个新颖的、先前未被认识的机制：Homo通过circRNA介导的ceRNA网络调节铁死亡的能力。我们具体确定了circDNMT3B/miR-20b-5p/SLC7A11轴。在SAP条件下，circDNMT3B表达受到抑制，其作为miR-20b-5p分子海绵的能力减弱。这导致游离的miR-20b-5p积累，进而在转录后抑制SLC7A11，从而损害GPX4系统并加剧铁死亡。
局限性与未来展望
本研究虽然建立了circRNA介导的ceRNA机制与SAP中铁死亡之间的新联系，但仍存在一些局限性。首先，治疗评估仅在单一剂量的Homo（15 mg/kg）下进行，剂量反应关系和最佳给药方案尚不清楚。其次，由于环状RNA载体构建的技术挑战，缺少circDNMT3B过表达模型，限制了双向功能验证。第三，circDNMT3B在SAP进展过程中的动态表达谱仍不清楚，其与Nrf2等通路的潜在协同效应值得进一步研究。最后，必须认识到动物模型固有的局限性，未来需要更大规模的临床队列研究来进一步验证Homo及其靶向通路在人类SAP中的有效性和安全性。
结论
总之，我们的研究结果表明，天然化合物高车前素（Homo）可能通过抑制铁死亡来预防SAP。我们提出了一个模型，其中这种保护作用至少部分是通过一个涉及上调circDNMT3B的通路实现的。我们的数据与以下机制一致：circDNMT3B充当miR-20b-5p的海绵，导致SLC7A11的上调以及随后的铁死亡抑制。这些见解有助于更好地理解SAP的发病机制，并突出了circDNMT3B/miR-20b-5p/SLC7A11轴作为未来治疗探索的潜在靶点。
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