犬牙周炎龈下细菌的抗菌药敏模式分析：来自秘鲁北部的第一手证据与临床启示

本文首次报告了秘鲁北部地区犬牙周炎龈下细菌的抗菌药敏模式，揭示了高水平的耐药性，特别是对甲硝唑（metronidazole）的耐药率高达87.9%，而对环丙沙星（ciprofloxacin）的耐药率较低（10.49%）。研究发现常见处方抗生素疗效有限，强调了经验性用药的风险，并呼吁在兽医牙科常规实践中进行培养指导治疗、药敏测试和实施抗菌药物管理策略，其发现对“同一健康（One Health）”理念下的抗生素耐药性监测具有重要价值。

1. 1.
   引言
   牙周病是犬类中极为普遍的疾病，由牙齿表面牙菌斑或细菌生物膜的过度积聚引起，可从牙龈炎发展为牙周炎。其患病率随年龄增长而升高，风险因素包括口腔护理不足、遗传、营养和行为等。该疾病可导致口臭、局部感染、牙齿脱落、疼痛、体重减轻和行为改变，甚至与全身性疾病相关。
   龈下生物膜是牙周炎犬疾病进展的主要细菌库。频繁暴露于抗菌药物，特别是在不合理或经验性使用的情况下，会产生持续的选择压力，促进具有增强耐药性特征的细菌种群出现。耐药基因已在犬唾液和牙菌斑中被报道，支持龈下细菌作为抗菌素耐药性发展和持续的相关储存库的观点。
   兽医领域抗菌素耐药性的出现是一个日益普遍的全球性问题。在此背景下，“同一健康（One Health）”方法认识到包括兽医医学在内的人、动物和环境健康部门之间进行耐药性监测和协调行动的重要性。伴侣动物与人类之间可能存在的耐药菌传播证据进一步支持了对伴侣动物进行药敏研究的相关性。
   一些研究表明，细菌耐药性的增加可能与犬牙周治疗期间频繁和经验性使用抗生素有关。因此，针对兽医牙科中常用抗生素的药敏研究对于指导合理的治疗决策和优化治疗结果至关重要。本研究旨在评估从牙周炎犬分离的龈下细菌的抗菌药敏模式，提供该研究区域抗菌素耐药性的首次报告。
2. 2.
   材料与方法
   2.1. 动物
   研究在秘鲁北部的皮乌拉进行。纳入标准为具有与牙周炎相符的口腔症状、成年、性别不限。仅纳入获得主人授权的患者。识别出现口臭、牙龈肿胀或出血、流涎、厌食、咀嚼困难和牙齿脱落等牙周症状的患者。排除标准包括临终患者、先前接受过抗菌治疗的犬以及患有并发疾病的患者。
   样本采集自49只有牙周症状的犬，这些犬在兽医中心接受诊治。在这些犬中，53%的年龄在3至7岁之间，47%在7至16岁之间。
   2.2. 样本采集
   研究在获得兽医中心负责人和患者主人的事先授权后进行。临床检查和采样在患者镇静后进行。通过牙周探诊评估龈沟深度，0至3毫米被视为正常。根据Stepaniuk描述的牙周阶段（2、3和4）对牙周病的严重程度进行分类。
   使用无菌木质拭子摩擦牙龈和牙周袋底部采集拭子样本，以分离需氧菌和兼性厌氧菌。此外，使用无菌镊子将无菌纸尖置于每颗牙齿的牙龈下20秒采集另一个样本。对于犬齿和前臼齿，总共采集了四支纸尖（无菌30号和40号纸尖各一支），以分离严格厌氧菌。拭子样本在含有蛋白胨水的试管中运输，纸尖样本在含有硫乙醇酸盐的试管中运输。样品在分别标识后，在4°C冷藏条件下运输至实验室进行处理。
   2.3. 实验室分析
   样本的细菌培养和抗菌药敏试验在皮乌拉国立大学兽医微生物学实验室进行。样本在37°C下孵育6小时。先前孵育过的含蛋白胨水的样本，接种于麦康凯琼脂、查普曼斯通琼脂、贝尔德帕克琼脂和血琼脂平板，在37°C有氧条件下倒置培养24小时。先前孵育过的含硫乙醇酸盐的样本，接种于血琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂平板，在37°C厌氧条件下培养15天。对菌落进行重新划线以获得纯培养物。基于革兰氏染色结果、菌落的宏观特征、酶学试验（过氧化氢酶和氧化酶）和生化试验（TSI琼脂和SIM培养基）对细菌进行分类和种水平鉴定。
   使用Kirby-Bauer琼脂纸片扩散法进行抗菌药敏试验。评估的抗生素包括克林霉素（clindamycin）、阿莫西林/克拉维酸（amoxicillin plus clavulanic acid）、甲硝唑（metronidazole）、环丙沙星（ciprofloxacin）、多西环素（doxycycline）和头孢氨苄（cephalexin）。抗生素的选择基于研究地区的可获得性和使用情况。方法学遵循临床和实验室标准协会（CLSI）指南，药敏结果的解释基于对含抗生素纸片周围细菌生长抑制区的测量。
   2.4. 统计分析
   使用卡方检验评估细菌种类与抗菌素耐药性谱之间的关联。当识别出统计学上显著的关联时，使用标准化残差进行事后分析。应用Bonferroni校正调整多重比较的显著性阈值。
   2.5. 伦理声明
   样本采集符合秘鲁第30407号国家法律（《动物保护与福利法》，自2016年1月7日起在秘鲁生效）。研究方案获得了兽医学院院长的批准。
3. 3.
   结果
   细菌分离和鉴定结果如表1和表2所示。共分离出305个纯菌落，其中55%为需氧菌和兼性厌氧菌，45%为严格厌氧菌。根据革兰氏染色结果，革兰氏阴性需氧和兼性厌氧菌（35%）以及革兰氏阴性严格厌氧菌（34%）是最常被鉴定的组别，其次是革兰氏阳性需氧和兼性厌氧菌（20%）和革兰氏阳性严格厌氧菌（11%）。此外，本研究鉴定了18个属的需氧和兼性厌氧菌以及13个属的严格厌氧菌。
   患者中检出率最高的需氧和兼性厌氧菌是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（79.59%）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）（34.69%）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）（32.65%）和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）（30.61%）。在168个分离菌落中，金黄色葡萄球菌的分离率最高（23%），其次是芽孢杆菌属（10%）、阴沟肠杆菌（10%）和奇异变形杆菌（9%）。
   患者中检出率最高的严格厌氧菌是牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）（53.06%）、韦荣球菌属（Veillonella sp.）（36.73%）、犬咬二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophaga canimorsus）（30.61%）、中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）（30.61%）和放线菌属（Actinomyces sp.）（30.61%）。在137个分离菌落中，牙龈卟啉单胞菌的分离率最高（19%），其次是韦荣球菌属（13%）、犬咬二氧化碳嗜纤维菌（11%）、中间普雷沃菌（11%）和放线菌属（11%）。
   需氧和兼性厌氧菌对抗生素的耐药谱如图1所示。对于大多数已鉴定的细菌属（88.9%），包括分离率最高的物种，本研究鉴定出80%或更多的分离菌株对甲硝唑耐药。在89%的药敏结果中鉴定出不同程度的耐药性。然而，一些细菌未显示耐药性，例如链球菌属（Streptococcus sp.）对多西环素耐药，以及弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）对几乎所有评估的抗生素耐药。此外，38.9%的细菌属对环丙沙星的耐药率为0%，其余属的耐药率高达40%。
   链球菌属、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）、乳杆菌属（Lactobacillus sp.）、肠球菌属（Enterococcus sp.）、阴沟肠杆菌、气单胞菌属（Aeromonas sp.）和放线杆菌属（Actinobacillus sp.）的分离菌株对甲硝唑的耐药率为100%。同样，链球菌属和肠球菌属的所有分离菌株对克林霉素和阿莫西林/克拉维酸耐药。链球菌属、类志贺邻单胞菌、肠球菌属和放线杆菌属的所有菌株也对头孢氨苄耐药，而肠炎沙门菌（Salmonella enterica）、变形杆菌属（Proteus sp.）、肠球菌属、弗氏柠檬酸杆菌和放线杆菌属的所有菌株对多西环素耐药。
   对于金黄色葡萄球菌和阴沟肠杆菌，对甲硝唑的耐药性显著高于其他抗生素。类似地，弗氏柠檬酸杆菌对多西环素的耐药性显著更高。相比之下，对于金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌属、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌属和类志贺邻单胞菌，对环丙沙星的耐药性显著低于其他抗生素。
   严格厌氧菌对抗生素的耐药谱如图2所示。对于大多数已鉴定的细菌属（84.6%），本研究鉴定出80%或更多的分离菌株对甲硝唑耐药。在83%的药敏结果中鉴定出不同程度的耐药性。然而，一些细菌未显示耐药性，例如沃林菌属（Wolinella sp.）对克林霉素耐药；细小杆菌（Parvicella tangerina）和沃林菌属对多西环素耐药；以及支原体属（Mycoplasma sp.）对四种评估的抗生素耐药。此外，53.8%的细菌属对环丙沙星的耐药率为0%，其余属的耐药率高达16.7%。
   沃林菌属、细小杆菌、支原体属和梭杆菌属（Fusobacterium sp.）的分离菌株对甲硝唑的耐药率为100%。此外，沃林菌属和支原体属的所有分离菌株对阿莫西林/克拉维酸耐药，沃林菌属和梭杆菌属的所有菌株对头孢氨苄耐药。
   对于牙龈卟啉单胞菌、韦荣球菌属、梭菌属（Clostridium sp.）和细小杆菌，对甲硝唑的耐药性显著高于其他抗生素。相比之下，对于牙龈卟啉单胞菌、韦荣球菌属、中间普雷沃菌、放线菌属、梭菌属和梭杆菌属，对环丙沙星的耐药性显著低于其他抗生素。
4. 4.
   讨论
   先前的研究在患有中度至重度牙周病的犬患者中更频繁地分离出牙龈卟啉单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。本研究中金黄色葡萄球菌的频率更高，这可能是因为使用了两种特定的琼脂（查普曼斯通琼脂和贝尔德帕克琼脂）进行分离。此外，牙龈卟啉单胞菌的频率相似。然而，与本研究中评估的来自收容所的犬相比，大肠杆菌的频率较低，这可能与卫生条件不佳以及舔舐肛门和食粪相关的污染有关。
   其他研究报道了牙周炎犬患者中卟啉单胞菌属（Porphyromonas sp.）最常出现。与本研究的发现相似，牙龈卟啉单胞菌也被其他研究报道；然而，一些研究确定最主要的物种是犬齿龈卟啉单胞菌（P. gulae）。不同研究中细菌属检测的变异性可能归因于样本量。一些关于口腔微生物组和犬牙周炎的研究因样本量小而受到限制，这限制了对需要更大群体才能可靠识别的低流行细菌的识别能力。
   本研究评估的抗生素（克林霉素、阿莫西林/克拉维酸、甲硝唑、环丙沙星、多西环素和头孢氨苄）是根据研究地区的可获得性和使用情况选择的。大多数评估的抗生素被报道为美国兽医诊所牙科手术中最常用的抗生素，包括牙科预防和拔牙。这些研究还发现，不同严重程度的牙周病患者中有很高比例接受了抗生素治疗。
   先前研究报道了金黄色葡萄球菌对克林霉素、多西环素、头孢氨苄和阿莫西林/克拉维酸的耐药性。本研究中，金黄色葡萄球菌对头孢氨苄、克林霉素、多西环素和阿莫西林/克拉维酸的耐药水平更高。同样，大肠杆菌对多西环素、头孢氨苄和阿莫西林/克拉维酸的耐药水平也更高，但对环丙沙星的耐药水平较低。
   本研究发现牙龈卟啉单胞菌对甲硝唑、头孢氨苄、克林霉素、阿莫西林/克拉维酸和多西环素具有高耐药模式，而对环丙沙星的耐药模式较低。其他研究报告了卟啉单胞菌对其他抗生素无耐药性，或对克林霉素和阿莫西林/克拉维酸有较低耐药性，以及牙龈卟啉单胞菌对环丙沙星和头孢氨苄的耐药性。
   本研究发现中间普雷沃菌对甲硝唑、头孢氨苄、多西环素、克林霉素和阿莫西林/克拉维酸具有高耐药模式，而对环丙沙星的耐药模式较低。其他研究也报道了该细菌对阿莫西林/克拉维酸、多西环素和甲硝唑的耐药性，以及对环丙沙星和头孢氨苄的耐药性。
   本研究的发现具有临床相关性，因为抗菌素耐药性限制了治疗选择，损害了治疗效果，并增加了临床失败和疾病复发的风险，最终影响生活质量以及专业实践和主人的信心。此外，本研究在公共卫生层面提供了相关证据，考虑到宠物与其主人之间可能存在细菌和抗菌素耐药性遗传决定因素的交换。
   观察到的对常规处方抗生素（如甲硝唑）的高耐药性可能与抗菌药物的经验性使用、牙科手术中广泛预防性给药以及微生物诊断和药敏测试的应用有限有关。这些做法对微生物组产生选择压力，并促进耐药细菌种群的出现。
   在常规兽医牙科实践中，这些发现强调了限制经验性抗菌药物使用以及优先考虑牙周病管理的预防和诊断方法的重要性。包括减少菌斑、家庭护理实践、定期兽医评估和监测以及使用替代疗法在内的预防策略可以减少对抗菌治疗的需求。此外，抗菌药物的预防性使用应仅限于特定的临床适应症和患者并发症，并符合现行指南。
   鉴定出对环丙沙星具有低耐药性或无耐药性的细菌分离株表明，在选定的病例中，这种抗菌药物可能仍然是一种可行的治疗选择。尽管如此，抗生素给药应仅限于临床合理的情况，并受药敏测试指导，且应遵循既定的抗菌药物使用指南。因此，标准化、实施和遵守抗菌药物管理指南对于促进负责任的使用至关重要。
   本研究的局限性包括缺乏使用聚合酶链式反应（PCR）、宏基因组测序和16S核糖体核糖核酸（16S rRNA）基因测序等技术进行分子确认。仅基于微生物培养方法的分离只能识别在实验室条件下能够生长的微生物，这可能导致对微生物多样性的低估。此外，一些细菌无法使用常规培养技术分离，需要特殊的生长条件，或在样本中丰度非常低，从而限制了对口腔微生物组的全面表征。
   本研究未评估细菌流行率与疾病严重程度之间的关联，因为采样策略和样本量并非旨在平衡代表牙周炎的所有阶段。因此，亚组分析的统计功效将不足。
   本研究集中于牙周炎犬的抗菌药敏性，未纳入健康的对照组，而对照组可以比较健康犬和牙周炎犬的口腔微生物。研究设计的差异也体现在这些研究中，一些研究仅包括轻度牙周病病例，一些研究未指定疾病严重程度，而另一些研究评估了轻度、中度和重度病例。这些差异限制了研究之间的直接比较。
   未来的研究应结合分子方法来表征口腔微生物组并评估微生物群落的相对丰度，这可能会影响特定物种的存在、致病性和抗菌素耐药性。此外，需要在其他地理区域进行研究，以评估区域耐药模式，并识别抗菌素耐药基因和相关的遗传决定因素。最后，评估抗菌药物管理指南以及牙周病预防和控制策略的有效性，将有助于优化兽医牙科中的抗菌药物使用。
5. 5.
   结论
   金黄色葡萄球菌和牙龈卟啉单胞菌是牙周炎犬中最常分离到的物种。龈下细菌对牙周治疗中常用药物表现出异质性的抗菌素耐药模式，大多数分离株主要表现为对甲硝唑的高耐药性以及对环丙沙星的低耐药性或无耐药性。
   抗菌素耐药性是一个日益普遍的全球性问题，它通过减少有效治疗方案的可得性威胁着兽医实践。本研究的结果为与犬牙周炎相关的龈下细菌的抗菌药敏谱提供了具有临床相关性的证据，并强调了在兽医牙科中持续经验性使用抗菌药物所带来的风险。
   这些结果支持了限制常规经验性抗菌药物处方以及优先考虑基于培养的诊断和药敏测试的必要性。抗生素的使用应仅限于有明确理由的病例，并与抗菌药物管理指南保持一致。此外，加强预防策略以减少对抗菌药物的依赖对于减缓抗菌素耐药性的进展至关重要，这对动物和公共卫生都具有潜在影响。