引言：弓形虫感染与宿主防御的未知领域
弓形虫病是由专性细胞内寄生原虫——刚地弓形虫（Toxoplasma gondii, Tg）引起的人畜共患病，在全球范围内流行。弓形虫具有复杂的生活史，可感染包括人类在内的所有温血动物。感染通常通过摄入被组织包囊污染的肉类或被猫粪便中卵囊污染的食物而获得。在免疫功能正常的个体中，感染多为无症状或症状轻微，但弓形虫可在中枢神经系统（CNS）内形成包囊，建立终身慢性感染。然而，对于免疫功能低下者（如艾滋病患者、器官移植受者）或孕妇，弓形虫病可导致严重的并发症，包括脑炎、脉络膜视网膜炎，甚至死亡。因此，阐明宿主控制弓形虫感染的免疫机制至关重要。
在宿主的先天免疫防御中，抗菌肽扮演着重要角色。Cathelicidin是一类具有抗菌和免疫调节功能的小分子阳离子多肽。在人类中，唯一的cathelicidin是LL-37，由其前体蛋白hCAP18经蛋白酶切割后释放产生；其小鼠同源物是由Camp基因编码的cathelicidin相关抗菌肽（CRAMP）。Cathelicidin主要由中性粒细胞、单核/巨噬细胞和上皮细胞分泌，不仅能够通过破坏微生物膜发挥直接的杀菌作用，还能通过调节细胞因子分泌、趋化反应和免疫系统激活来增强宿主防御。已有研究表明，cathelicidin在小鼠对抗利什曼原虫、铜绿假单胞菌和幽门螺杆菌的感染中具有保护作用，但其在弓形虫感染中的作用尚不清楚。本研究旨在利用猫源性抗菌肽缺陷（Camp-/-）小鼠模型，探究内源性cathelicidin在弓形虫口服感染过程中的保护功能。
材料与方法：构建口服弓形虫病模型
研究采用6-8周龄的野生型C57BL/6（Camp+/+）小鼠和cathelicidin基因敲除（Camp-/-）小鼠。通过口服灌胃的方式，给每只小鼠接种5个低毒力II型弓形虫ME-49株的包囊，以模拟自然感染途径。之所以选择相对较低的接种剂量（5个包囊），是为了避免过高剂量引发的过度Th1细胞因子风暴、肠道坏死和早期死亡，从而便于评估宿主的免疫反应。对照组小鼠口服等量的磷酸盐缓冲液（PBS）。每日监测小鼠体重和行为，感染后第14天处死小鼠，采集血液、肝脏、脾脏、结肠、回肠和脑组织进行后续分析。研究严格遵守动物福利准则，对体重下降超过20%或出现严重症状的小鼠实施安乐死。
为了探究细胞机制，研究使用了人单核细胞系THP-1诱导分化的巨噬细胞（dTHP-1）以及从小鼠骨髓中分离培养的骨髓源性巨噬细胞（BMDM）。用弓形虫速殖子以不同的感染复数（MOI）刺激这些细胞，并检测细胞因子的产生、cathelicidin的表达以及细胞内弓形虫的载量。此外，还通过外源性添加合成的人cathelicidin（LL-37）来评估其对巨噬细胞功能的影响。
组织病理学分析是评估器官损伤的关键。肝脏、脾脏、脑等组织样本经福尔马林固定、石蜡包埋后，进行苏木精-伊红（H&E）染色，由专业的兽医病理学家进行评估。通过ImageJ软件对肝组织切片中的坏死区域进行定量形态学分析。同时，利用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测各组织中促炎细胞因子（Ifn-γ, Tnf-α, Il1-β）和Camp基因的转录水平。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和多重液相芯片技术（Luminex）分别检测细胞培养上清和小鼠血浆中的细胞因子浓度。弓形虫的载量通过针对其多拷贝B1基因的qPCR进行定量，而组织中的包囊则通过针对弓形虫抗原的免疫组织化学（IHC）染色进行检测和计数。为了深入探索分子机制，研究还对感染小鼠的肝脏组织进行了基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的定量鸟枪法蛋白质组学分析。
结果：Cathelicidin缺陷导致严重的疾病结局
1. Camp-/-小鼠在弓形虫感染中发病更重、死亡率更高
与野生型对照相比，Camp-/-小鼠在感染弓形虫后表现出更严重的临床症状。从感染后第9天左右开始，Camp-/-小鼠出现嗜睡、毛发粗糙等症状，体重下降更为显著（约20%，而Camp+/+小鼠约下降10%）。更重要的是，所有感染弓形虫的Camp-/-小鼠均在感染后12天内因体重急剧下降超过20%而达到人道终点并被实施安乐死。相比之下，所有感染弓形虫的Camp+/+小鼠均存活至研究结束（14天）。PBS对照组小鼠则未出现任何临床症状，体重稳步增加。这些结果表明，内源性cathelicidin对于维持宿主在弓形虫感染过程中的存活至关重要。
2. Cathelicidin保护肝脏免于严重坏死性肝炎
肝脏是弓形虫病中常受累的器官。组织学检查发现，感染弓形虫的Camp+/+和Camp-/-小鼠肝脏均出现不同程度的炎性细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞）浸润。然而，Camp-/-感染小鼠的肝脏病变远为严重，表现为弥漫性库普弗细胞增生和严重的多灶性坏死性非化脓性肝炎，其坏死病灶面积显著大于Camp+/+感染小鼠。肝脏中促炎细胞因子Ifn-γ、Tnf-α和Il1-β的基因转录水平在Camp-/-感染小鼠中也呈现出高于野生型感染小鼠的趋势。
蛋白质组学分析进一步揭示了肝损伤的分子基础。与Camp+/+感染小鼠相比，Camp-/-感染小鼠的肝脏中，鸟苷酸结合蛋白1（Gbp2b）和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶3（PARP3）的表达显著上调（分别上调5.5倍和3.5倍）。GBPs是干扰素诱导的GTP酶家族，参与对抗细胞内病原体的防御；PARPs则参与DNA修复和炎症反应。这些蛋白的上调可能与Camp-/-小鼠肝脏中过度放大的炎症反应和细胞死亡有关。
3. 肠道的炎症反应无明显差异
与肝脏的显著病变不同，在感染后第14天，Camp+/+和Camp-/-小鼠的肠道（结肠和回肠）均未出现明显的肠炎迹象。两组小鼠的结肠长度、组织学结构（上皮完整性、炎性细胞浸润）以及结肠和回肠中促炎细胞因子的转录水平均无显著差异。仅观察到Camp-/-感染小鼠回肠中的杯状细胞数量有轻微减少的趋势。这表明，在本研究采用的较低剂量感染模型中，cathelicidin的缺失并未加重弓形虫感染引起的肠道炎症。
4. Cathelicidin限制脑内包囊形成和炎症病变
弓形虫感染后期会侵入中枢神经系统形成包囊。组织学分析显示，感染弓形虫的Camp+/+小鼠脑部未见明显病变或炎性细胞浸润。相反，Camp-/-感染小鼠则出现了非化脓性脑炎，表现为淋巴细胞、巨噬细胞浸润、反应性星形胶质细胞增生以及血管周围套管现象。尽管两组小鼠脑组织中Ifn-γ、Tnf-α和Il1-β的基因表达水平相似，但免疫组化检测发现，所有Camp-/-感染小鼠（5/5）的脑内均检测到弓形虫包囊，而高达40%的Camp+/+感染小鼠（2/5）脑内未检测到包囊，且Camp-/-组脑内包囊数量显著更高。这表明cathelicidin的缺失可能导致宿主无法有效限制弓形虫在脑内的定植和包囊形成。
5. 全身性炎症失控，而非寄生虫负荷差异
通过qPCR检测多个器官（结肠、回肠、肝脏、脾脏、脑）中的弓形虫B1基因载量，发现Camp+/+和Camp-/-感染小鼠之间的寄生虫负荷没有显著差异。然而，在全身水平上，Camp-/-感染小鼠血浆中的关键促炎细胞因子，特别是Ifn-γ和Tnf-α的浓度显著高于Camp+/+感染小鼠。这表明，内源性cathelicidin的主要作用可能不是直接抑制弓形虫的播散，而是调节宿主的免疫反应，防止感染引发的过度全身性炎症风暴。
6. 巨噬细胞中cathelicidin的免疫调节作用
体外细胞实验进一步阐明了机制。研究发现，人巨噬细胞（dTHP-1）在受到弓形虫刺激后，其内源性cathelicidin（CAMP/LL-37）的表达和分泌均增加，同时促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的合成也上调。更重要的是，比较Camp+/+和Camp-/-小鼠来源的骨髓源性巨噬细胞（BMDM）发现，尽管两组细胞内的弓形虫载量相似，但Camp-/-BMDM在感染后分泌的Tnf-α显著多于Camp+/+BMDM。外源性添加合成的LL-37多肽并不能在短时间内直接减少巨噬细胞内的弓形虫载量。这些结果综合表明，内源性cathelicidin在巨噬细胞中扮演了免疫调节者的角色，通过下调促炎细胞因子（特别是TNF-α）的过度产生来限制炎症，而非直接杀伤弓形虫。
讨论：Cathelicidin——免疫调节的“盾牌”而非直接攻击的“矛”
本研究系统揭示了内源性抗菌肽cathelicidin在弓形虫口服感染中的保护性作用。其核心机制并非之前广为人知的直接抗菌/抗寄生虫活性，而是一种关键的免疫调节功能。Cathelicidin像一个“盾牌”，通过抑制促炎细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）的过度合成，来防止感染引发的免疫病理损伤，从而保护肝脏、脑等重要器官，维持宿主内环境稳定，最终提高生存率。
在肝脏中，cathelicidin的缺失导致了严重的坏死性肝炎，这与促炎细胞因子风暴以及PARP3、GBPs等炎症相关蛋白的上调密切相关。在脑中，cathelicidin的缺失则与更高的包囊负荷和更严重的炎症病变相关，提示其有助于限制弓形虫在中枢神经系统的慢性定植。值得注意的是，cathelicidin的缺失并未改变全身各器官的寄生虫总体负荷，却显著加剧了全身性的炎症反应。这清晰地将其角色定位为“炎症刹车”，而非“寄生虫杀手”。
在细胞层面，巨噬细胞是cathelicidin发挥作用的重要效应细胞。弓形虫感染可诱导巨噬细胞自身产生cathelicidin，而内源性的cathelicidin（CRAMP）能够反馈性地抑制感染所引发的TNF-α等促炎因子的过度分泌，形成一个负反馈调节回路，防止炎症失控。
这项研究的发现拓展了我们对cathelicidin生物学功能的理解，将其从传统的直接效应分子提升为关键的免疫稳态调节器。尤其是在弓形虫病这种需要平衡抗寄生虫免疫与免疫病理损伤的感染中，cathelicidin的这种调节作用显得尤为重要。研究结果为理解宿主与弓形虫相互作用的复杂免疫网络提供了新视角，也可能为未来开发针对过度炎症反应的辅助治疗策略（例如，基于cathelicidin或其衍生多肽的免疫调节疗法）提供理论依据。当然，研究也存在一定局限性，例如使用的弓形虫毒力株单一、动物样本量有限等，未来需要更多研究来验证cathelicidin在不同感染模型和临床情境中的普遍意义。
