丁志明|吴彩云|李轩曦|徐燕|苏晓晓|欧慧慧|马聪|徐祖英|周萍|曹云霞|向慧芬
安徽医科大学第一附属医院，国家卫生健康委员会异常配子与生殖道研究重点实验室，中国安徽省合肥市鸡西路218号
摘要
卵母细胞减数分裂过程中的异常是女性不孕的主要原因之一。O-GlcNAc转移酶（OGT）介导的O-GlcNAcylation是一种蛋白质的翻译后修饰，参与多种生物过程。然而，其在卵母细胞成熟过程中的具体功能仍不清楚。在本研究中，我们利用Gdf9-Cre基因在发育中的小鼠卵母细胞中条件性敲除OGT，发现这会导致完全的不孕，并伴随卵母细胞成熟障碍和卵泡发育缺陷。尽管纺锤体形态和染色体排列没有明显差异，但OGT缺乏会损害着丝粒与微管的连接。结果，纺锤体组装检查点被激活，导致减数分裂停滞。多组学分析显示，OGT敲除不仅破坏了与卵母细胞减数分裂相关的生物过程，还影响了线粒体呼吸链复合体I的功能。进一步验证表明，OGT敲除会干扰NADH向NAD+的转化，从而证实OGT敲除确实损害了线粒体呼吸链复合体I的功能。通过共免疫沉淀和质谱分析，我们发现了OGT与线粒体复合体I亚基NDUFA8之间的相互作用。OGT敲除降低了NDUFA8的蛋白质水平，可能导致了线粒体呼吸链复合体I的功能障碍。因此，OGT的缺失引发了线粒体功能障碍，表现为分布异常、膜电位下降和氧化应激增加，最终导致ATP生成减少。综上所述，我们的数据证实OGT通过调节线粒体呼吸链复合体I的功能，在卵母细胞成熟和女性生殖中起着关键作用。
引言
高质量、具有受精能力的卵母细胞的产生依赖于减数分裂的精确执行，这一过程对于成功的受精和随后的胚胎发育至关重要。哺乳动物卵母细胞中减数分裂重新开始的标志性事件是核膜的溶解，这一过程称为生殖泡破裂（GVBD）。随后发生染色体浓缩和减数分裂纺锤体的组装。到第一次减数分裂中期（MI），纺锤体微管捕获染色体并将它们排列在赤道板上，为后续分离做准备。纺锤体组装检查点（SAC）是一种重要机制，通过延迟后期直到所有着丝粒正确连接到纺锤体微管并且同源染色体准确对齐，从而确保染色体的忠实分离。一旦这些条件得到满足，SAC就会被解除，触发后期和同源染色体的分离。卵母细胞随后通过排出第一个极体（PB1）完成第一次减数分裂，并在第二次减数分裂中期（MII）停滞，等待受精。与此同时，卵母细胞的成熟涉及重要的细胞质重塑，其中线粒体的分布和活性发生动态变化。由于线粒体是ATP的主要来源，其正确的定位和功能能力在整个成熟过程中至关重要。ATP供应不足会干扰减数分裂进程，导致纺锤体组装和染色体分离错误，从而影响卵母细胞的质量和发育能力。卵母细胞成熟缺陷与女性生殖问题直接相关，包括排卵功能障碍、胚胎发育停滞和不孕。尽管在揭示卵母细胞发育调控机制方面取得了显著进展，但对控制卵母细胞质量的关键因素仍缺乏全面理解。蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是在蛋白质合成期间或之后，通过酶催化的反应将功能基团添加到特定氨基酸残基上的生化过程。这些修饰可能是可逆的或不可逆的，通过调节蛋白质的稳定性、亚细胞定位、催化活性和与其他生物分子的相互作用，扩展了蛋白质的功能多样性。在卵母细胞中，减数分裂期间转录活性被抑制，使得蛋白质的翻译后调控尤为重要。已在卵母细胞中鉴定出多种类型的PTMs，表明它们在卵母细胞成熟的不同阶段和环境中具有多样的调控作用。例如，磷酸化参与哺乳动物卵母细胞的减数分裂重新开始、纺锤体组装和染色体排列；泛素化介导的蛋白质降解对于从减数分裂中期到末期的过渡至关重要；SUMO化调节卵母细胞发育的多个方面，包括基因表达、MII纺锤体组织、极体排出和着丝粒-微管连接；PARylation不仅参与DNA损伤修复，还参与卵母细胞减数分裂中的不对称分裂。此外，DPAGT1（一种N-糖基化关键酶）的错义突变会损害卵母细胞成熟，降低卵母细胞质量，从而导致小鼠不孕。此外，组蛋白乙酰转移酶KAT8也被证明通过影响活性氧水平来调节小鼠卵母细胞。尽管取得了这些进展，但大多数PTMs在卵母细胞中的生物学功能仍大部分未被探索。
蛋白质O-连接的N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰，通常称为O-GlcNAcylation，是一种可逆且动态的糖基化形式，其特征是单个N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）基团连接到目标蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上。与其他许多PTMs复杂的调控机制不同，O-GlcNAcylation仅由两种高度保守的酶介导：OGT（作为“写入者”，催化将GlcNAc从尿苷二磷酸-GlcNAc（UDP-GlcNAc）添加到丝氨酸或苏氨酸残基上）和OGA（作为“擦除者”，从O-GlcNAcylated蛋白质上去除GlcNAc）。作为一种广泛的PTM，O-GlcNAcylation几乎存在于所有人体组织中。已鉴定出数千种O-GlcNAcylated蛋白质，包括转录因子、线粒体蛋白、翻译相关蛋白以及蛋白酶体和激酶家族的成分。通过调节目标蛋白质的生物学功能，O-GlcNAcylation调控多种细胞过程，如细胞周期控制、代谢、信号转导、转录调控、表观遗传学、蛋白质运输和应激反应。最近的研究越来越多地表明，O-GlcNAcylation在生殖中起着重要作用。OGT和O-GlcNAcylated蛋白质存在于睾丸和附睾中，在精子成熟过程中逐渐减少。在秀丽隐杆线虫中敲除OGT的同源物（ogt-1）会导致精子数量减少和后代数量下降。OGT和O-GlcNAcylated蛋白质也存在于卵巢、卵母细胞和胚胎中。OGT活性的改变会影响多种物种的卵母细胞发育能力。在非洲爪蟾中，提高OGT水平会促进减数分裂进程，而抑制OGT则会延缓这一过程。此外，在非洲爪蟾卵母细胞中抑制OGT还会导致纺锤体形成异常。这些研究主要通过体外药理学方法探讨OGT介导的O-GlcNAcylation在卵母细胞成熟中的作用。体内卵母细胞成熟受多种因素影响，并涉及遗传补偿效应；然而，目前缺乏直接证据表明OGT介导的O-GlcNAcylation在此过程中发挥作用。
OGT是目前已知唯一催化O-GlcNAcylation的酶，对其基因组范围敲除的小鼠胚胎具有致死性，这表明它对胚胎存活至关重要。为了探讨OGT在女性生育和卵母细胞发育能力中的具体作用，我们生成了卵母细胞特异性的OGT敲除小鼠。我们的结果显示，在发育中的卵母细胞中条件性删除OGT会导致卵母细胞成熟障碍、卵泡发育缺陷和随之而来的不孕。
小鼠品系
我们使用Cre-loxP系统生成了卵母细胞特异性的OGT敲除小鼠。LoxP位点被插入OGT基因外显子2和3两侧的内含子区域（以下简称Ogtfl/fl），该区域包含425个碱基对的编码序列。删除这一区域会导致小鼠中OGT基因的功能丧失。Ogtfl/fl小鼠（品系S-CKO-00668）和Gdf9-Cre小鼠来自Cyagen Biosciences（中国苏州）。所有小鼠均来自C57BL/6J遗传背景。
小鼠卵母细胞减数分裂过程中OGT和O-GlcNAcylation的表达及亚细胞定位
为了研究OGT在卵母细胞减数分裂过程中的潜在作用，我们首先通过免疫印迹法评估了其在不同成熟阶段的蛋白质表达情况。结果显示，在GV、GVBD、MI和MII阶段均存在OGT蛋白，GVBD后OGT蛋白表达略有减少（图1A和B）。随后通过荧光成像分析OGT在卵母细胞中的亚细胞分布，发现其在GV阶段主要位于细胞核内。
讨论
OGT介导的O-GlcNAcylation在出生后卵母细胞发育中的作用，特别是在卵泡生成中的作用，仍不清楚。先前的药理学研究表明，在体外条件下，O-GlcNAcylation水平升高不会损害GV阶段卵母细胞的减数分裂成熟，包括PB1的排出，表明卵母细胞对O-GlcNAcylation的增加具有耐受性。然而，卵母细胞是否同样耐受O-GlcNAcylation水平的降低尚不清楚。
CRediT作者贡献声明
马聪：数据整理。欧慧慧：验证、正式分析。苏晓晓：验证、正式分析。徐燕：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。李轩曦：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。吴彩云：撰写——初稿、项目管理、方法学、研究、正式分析。丁志明：撰写——初稿、项目管理、方法学、研究、正式分析。向慧芬：撰写——审稿与
数据获取
如需数据，可向相应作者提出合理请求。RNA-seq数据和蛋白质组数据可通过ProteomeXchange获取，标识符分别为PXD071865和PXD071809。
利益冲突
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82301862）、国家重点研发计划（项目编号：2023YFC2705504）、安徽省自然科学基金（项目编号：2023AH050653）、安徽省科技创新平台重点研究计划（项目编号：202305a12020016）以及安徽教育委员会大学自然科学基金（项目编号：2022AH010072）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。所有作者均已阅读并批准了手稿。
致谢
作者感谢安徽医科大学国家卫生健康委员会异常配子与生殖道研究重点实验室的所有成员的支持。
